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研究背景:结直肠癌是世界常见的消化系统恶性肿瘤之一,在我国人群中结直肠癌发病率达28.2/10万,且发病率呈不断上升的趋势。尽管,随着结肠镜技术的普及与发展显著提高了结直肠癌的诊断率,同时配合外科手术及术后放化疗等综合治疗,早期结直肠癌患者的生存率得到了显著改善,但进展期结直肠癌患者因无法行手术治疗或术后缺乏行之有效的治疗方案,仍预后不良,生存期短。结直肠癌的增殖和转移是导致进展期患者术后复发及远处转移进而预后不良的主要因素。随着国内外众多学者对结直肠癌的深入研究发现结直肠癌的增殖和转移是多因素诱导,多基因改变和多信号通路异常的结果,但其分子机制仍不明确。因此,深入研究结直肠癌增殖和转移的机制,积极寻找特异性的分子标志物和有效的分子治疗靶点,有助于进一步改善结直肠癌患者的预后。泛醌蛋白4（Ubiquilin 4,UBQLN4）,属于泛素类蛋白家族,在调控泛素蛋白酶体降解过程中发挥重要作用。越来越多的研究表明UBQLN4在多种肿瘤中存在异常表达,在调控肿瘤的发生发展中起重要作用。然而,UBQLN4在结直肠癌中是否存在差异表达,能否调控结直肠癌的增殖和转移仍然未知。本研究检测了 UBQLN4在结直肠癌组织样本中的表达,并分析了其与结直肠癌患者临床病理参数的关系,探索了 UBQLN4对结直肠癌细胞生物学功能的影响,在转录水平阐述了 UBQLN4在结直肠癌中异常表达的机制,并进一步探索了UBQLN4发挥促癌作用的分子机制。研究方法:1.UBQLN4在结直肠癌中的表达量及其与临床病理参数的关系利用R语言探索了癌症基因组图谱数据库（The Cancer GenomeAtlas,TCGA）中UBQLN4在结直肠癌中表达情况,随后运用实时定量PCR（Real-time quantitative PCR,RT-qPCR）和免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）技术进行了验证,并分析了 UBQLN4的表达水平与结直肠癌患者的临床病理参数的相关性。2.UBQLN4的异常表达对结直肠癌表型的影响在结直肠癌细胞系（HCT-8、SW480）中过表达或敲减UBQLN4的表达量,通过克隆形成实验、MTS实验和transwell实验检测UBQLN4在体外对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。裸鼠皮下成瘤实验检测UBQLN4在体内对结直肠癌细胞增殖的影响。3.UBQLN4异常表达的上游机制研究将UBQLN4转录起始位点上游2000bp及其截短序列分别构建到PGL3-basic质粒载体中。采用双荧光素酶报告基因实验,明确UBQLN4的核心启动子结合区域和转录因子。RT-qPCR、蛋白质印迹（Western blot）和染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation assay,ChIP）实验进一步验证转录因子与UBQLN4的结合能力。4.UBQLN4发挥促癌作用的机制研究通过对TCGA数据库进行GSEA通路富集分析发现UBQLN4的高表达可显著激活Wnt/β-catenin通路,并通过Western blot进行了验证。研究结果:1.UBQLN4在结直肠癌中的表达量及其与临床病理参数的关系TCGA数据库显示UBQLN4在结直肠癌中高表达,同时RT-qPCR和IHC结果也均显示UBQLN4在结直肠癌组织中高表达。UBQLN4的高表达与肿瘤直径、肿瘤分化和N分期相关。生存分析结果提示UBQLN4高表达患者预后不良。2.UBQLN4的异常表达对结直肠癌表型的影响体外细胞功能实验显示,过表达UBQLN4可以显著增强结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。敲减UBQLN4可以抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。体内裸鼠皮下成瘤实验显示,敲减UBQLN4的表达可以显著抑制肿瘤的生长。3.UBQLN4异常表达的机制研究双荧光素酶报告基因实验表明UBQLN4的核心启动子区域位于其上游125bp-250bp之间。利用生物信息学预测网站进行预测和进一步实验验证表明CCAAT/增强子结合蛋白 β（CCAAT/enhancer-binding protein beta,C/EBPβ）可直接作用于UBQLN4的核心启动子区域,激活UBQLN4的转录上调其在结直肠癌中的表达。4.UBQLN4发挥促癌作用的机制研究Western blot实验结果表明UBQLN4可激活Wnt/β-catenin信号通路促进下游靶基因c-Myc的转录,导致c-Myc表达量增加,从而发挥促癌作用。体外拯救实验,结果表明在结直肠癌细胞系中敲减c-Myc的表达可以逆转过表达UBQLN4对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用,而过表达c-Myc可以逆转敲减UBQLN4对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用,以上实验进一步证实了UBQLN4与c-Myc间的调控关系。研究结论:UBQLN4在结直肠癌中高表达,高表达UBQLN4的患者预后差。转录因子C/EBPβ能够与UBQLN4的启动子区域结合促进其转录,上调其表达。UBQLN4在结直肠癌中通过激活Wnt/β-catenin信号通路,促进其下游靶基因c-Myc的转录,从而上调c-Myc的表达,进而促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。