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第一部分多发性硬化患者IL-22、Foxp3和Ikaros表达及关系的研究目的:探讨IL-22、Foxp3和Ikaros在多发性硬化(MS)患者中的表达水平及关系。方法:收集多发性硬化患者和健康志愿者的外周血,采用淋巴细胞分离液Ficoll密度梯度离心分离外周血单个核细胞,磁珠分选法分离纯化CD4+T细胞,流式细胞术检测Th22比例及Treg比例;ELISA分析外周血IL-22的表达水平;实时定量PCR法检测PBMC中Foxp3和Ikaros的表达。结果:与正常志愿者相比,MS患者CD4+CCR4+CCR6+CCR10+IL-22+T细胞,即Th22细胞比例增加,CD4+CD25+Foxp3+的Treg细胞比例减少。MS患者血清中IL-22的水平增加,PBMC中Foxp3和Ikaros的表达降低。结论:MS患者Th22细胞及相关因子IL-22增加,Treg细胞及相关因子Foxp3和Ikaros减少,IL-22高表达可能调控了 Foxp3的表达。第二部分实验性自身免疫性脑脊髓炎模型IL-22表达及脑内Fas水平的研究目的:探讨IL-22、Treg和Fas在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型的水平及关系。方法:MOG35-55联合百日咳毒素(PTX)免疫C57BL/6小鼠制备EAE小鼠模型,监测小鼠体重变化及临床症状评分判定模型成功与否。ELISA检测外周血清IL-22表达,流式细胞术检测外周血调节性T细胞(Treg)细胞比例,Western Blot和荧光实时定量PCR检测脑组织Fas表达。结果:EAE组小鼠体重显著下降且伴有行动迟缓、四肢瘫痪等神经功能障碍甚至死亡,造模成功。与正常组小鼠相比较,EAE小鼠外周血清中IL-22水平显著增加,外周血Treg比例明显降低,脑组织Fas表达增加。血清IL-22水平与脑组织Fas表达呈正相关,与外周血Treg比例呈负相关。结论:IL-22可能通过影响外周血Treg比例和脑组织Fas表达调控EAE发病。第三部分IL-22对多发性硬化少突胶质细胞Fas和调节性T细胞Foxp3表达及信号通路的研究目的:探讨IL-22、Treg和Fas之间的关系以及它们在MS病程中的作用,分析三者之间的关系以及IL-22调控Foxp3和Fas的信号通路。方法:构建表达IL-22的原核表达质粒,制备纯化重组IL-22蛋白。B104细胞与CG4细胞联合培养,使CG4细胞分化为少突胶质细胞,同时取胚胎小鼠的脑组织,分离原代少突胶质细胞,用IL-22蛋白处理CG4细胞和小鼠原代少突胶质细胞。Western Blot检测细胞内磷酸化的MSK1(Thr581)、MSK1、磷酸化的NF-κB p65(Ser468)、NF-κBp65 和 Fas 的表达水平。实时定量 PCR 检测 Fas、Ikaros的表达。检测受试者中p65、PTEN、PI3K、AKT、FoxO1、Ikaros和Foxp3的表达水平,以验证IL-22在细胞水平上对Foxp3的调控表达。在体外将正常的CD4+T细胞给予 IL-22 蛋白处理,检测 p65、PTEN、PI3K、AKT、FoxO1、Ikaros 和 Foxp3的表达水平。磁珠分选法分离正常小鼠和EAE小鼠的Treg细胞,并进行细胞计数。然后将其与IL-22处理的小鼠原代少突胶质细胞共培养,收获少突胶质细胞后,检测Fas的表达。结果:成功构建人/鼠的IL-22原核表达质粒PET20b-IL-22,并制备了重组IL-22的蛋白。IL-22促进胶质细胞中p-MSK1、p-P65和Fas的表达。IL-22促进T细胞中 p-P65 和 p-AKT 的表达,抑制 PTEN、FoxO1 和 Ikaros、Foxp3 的表达。Treg细胞能逆转IL-22导致的Fas表达。结论:IL-22通过激活MSK-NFkB信号通路促进MS/EAE中Fas表达诱导少突胶质细胞凋亡,IL-22通过活化NFκB-PTEN-AKT信号通路抑制MS/EAE中Treg细胞的转录因子Foxp3的表达,Treg细胞能逆转少突胶质细胞凋亡。第四部分青蒿素对实验性自身免疫性脑脊髓炎模型脑内小胶质细胞作用及机制研究目的:阐明在EAE中炎症小体的作用以及青蒿素对于EAE中小胶质细胞的影响。方法:体外实验,青蒿素处理小胶质细胞系BV-2细胞,ELISA法检测IL-1β的水平;青蒿素处理小鼠原代小胶质细胞后与磁珠分选的T细胞共培养,流式检测T细胞以及Treg细胞。体内实验,建立EAE动物模型,分别给予青蒿素、格列苯脲治疗,Western Blot检测小鼠脑组织炎症小体NLRP3的表达,流式检测IL-10、TNF-α的表达;分离小鼠脑组织中的T细胞,流式细胞术检测T细胞的比例、功能以及Treg的含量。结果:青蒿素可以抑制LPS和ATP诱导的BV-2细胞释放IL-11β;小鼠的原代小胶质细胞经体外青蒿素处理后与T细胞共培养,发现青蒿素可以增加Treg的比例以及IL-10的水平;在EAE模型中,青蒿素治疗组脑组织NLRP3表达下降;与对照组和格列苯脲组比较,小胶质细胞中IL-10的表达水平增加而TNF-α的水平下降,脑组织T细胞中Treg比例增加。结论:青蒿素能显著降低EAE动物模型的炎症反应,可能成为临床上治疗MS的潜在药物。