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[目的]： 1.对五种肠杆菌科细菌（埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、肠杆菌属与克雷伯菌属）TolC基因序列及蛋白质一级结构进行比对，比较属间相似性。 2.以大肠埃希菌TolC晶体结构为模板，对其余四个属细菌的TolC进行同源建模，并分析其空间构象及参与外排泵装配相关氨基酸位点的异同。 3.敲除大肠埃希菌E.coli DH5α的TolC基因;构建五种肠杆菌科细菌TolC的组成性表达载体，并转化E.coli DH5α，使不同TolC基因在E.coli DH5α中表达，形成杂合AcrAB-TolC外排泵。通过比较携带不同TolC基因的E.coli DH5α对典型TolC底物的MIC，间接反应杂合型AcrAB-TolC外排泵是否能够成功装配并形成具有功能的多耐药外排泵。 [方法]： 1.TolC基因序列的比对:根据文献报道，通过ClustalW2预测五种临床常见肠杆菌科细菌TolC的同源性，比较属间相似性。 2.同源建模及蛋白质结构比较:由于目前尚无其他肠杆菌科细菌TolC晶体结构的报道，于是，我们采用Swiss-Model在线同源建模软件，以大肠埃希菌的TolC晶体结构作为模板，构建其他四种细菌TolC的晶体结构;然后采用VMD软件分析五种细菌的TolC的三维结构及外排泵装配关键氨基酸位点，预测其他四种TolC与大肠埃希菌AcrB、AcrA装配的的可能性。 3.E.coli DH5α TolC的敲除:采用Red同源重组系统（质粒pKD46），将拟敲除的TolC基因替换为一段两端含有FRT位点的卡那霉素抗性基因。再通过pCP20质粒表达的Flp重组酶，作用于FRT位点，消除抗性基因，从而完全敲除菌株体内TolC基因。 4.TolC表达载体的构建:采用HindⅢ与BspHI核酸内切酶切除质粒pTrc99A带有的氨苄青霉素抗性启动子及其开放阅读框（open read frame，ORF），将五种TolC ORF插入到HindⅢ与BspHI酶切位点，使TolC基因的表达位于启动子 Ptrc调控下，获得TolC组成性表达载体。 5.最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）的测定:用微量肉汤稀释法检测MIC。挑选具有代表性的抗生素，将培养物与抗生素在96孔板中混匀，于37℃普通空气孵箱中孵育16～20h后判断结果。以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。 [结果]： 1.TolC基因序列的比对:我们通过Clustal W2提供的在线序列比对，对这五种肠杆菌科细菌多重耐药外排泵AcrAB-TolC的TolC进行序列比对分析，比对了多种临床常见肠杆菌科细菌TolC的同源性（埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、肠杆菌属与克雷伯菌属），结果发现大肠埃希菌与其他四个属细菌TolC的核酸序列属间同源性分别达到98％、82％、80％与78％，氨基酸序列属间同源性分别达到99％、89％、84％与83％;除此之外，TolC与AcrB作用的关键位点氨基酸及其周围序列完全一致。另外，通过对其他四个属细菌之间相互比较，发现其氨基酸序列的同源性也都在80％以上。 2.同源建模及蛋白质结构分析:我们进一步采用Swiss Model软件，以大肠埃希菌TolC的蛋白质晶体结构(PDB:1EK9)作为模板进行同源建模技术，获得了其他四种细菌TolC的三维结构。通过对蛋白质结构进行比较发现，这五种细菌的TolC出口端的形状、各维度的尺寸等空间构象参数相似性极高，且参与外排泵组装的关键氨基酸所处的位置也极为相似。 3.敲除E.coli DH5α的TolC:抗生素抗性及PCR检测结果表明，E.coli DH5α的TolC基因被成功敲除。 4.构建杂合AcrAB-TolC外排泵:成功构建TolC的组成性表达载体，通过检测MIC发现，志贺菌属、沙门菌属、肠杆菌属与克雷伯菌属的TolC均能与大肠埃希菌的AcrB-AcrA装配成具有功能的杂合型外排泵。 5.MIC检测结果:挑选五种具有代表性的物质，脱氧胆酸钠、氯霉素、四环素、SDS、氨苄青霉素，采用微量肉汤稀释法检测MIC。结果发现:杂合型AcrAB-TolC与野生型AcrAB-TolC相比:①杂合型AcrAB-TolC的外排泵对五种物质依旧耐药;②敲除TolC基因的大肠埃希菌的MIC明显降低;③没有出现杂合型AcrAB-TolC MIC升高;④杂合型AcrAB-TolC与野生型AcrAB-TolC相比的MIC略有下降，但不具有显著差异。 [结论]： 1.肠杆菌科细菌的TolC在基因与氨基酸序列上具有较高的相似性，其空间构象也极为相似，而且在与大肠埃希菌AcrB相互作用的氨基酸位点上也极为相似。 2.采用Red同源重组技术成功敲除E.coli DH5α的TolC基因，并成功构建不同肠杆菌科细菌TolC基因的组成性表达载体。 3.通过检测MIC值发现志贺氏菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌与肺炎克雷伯菌的TolC能与大肠埃希菌的AcrA-AcrB形成具有活性的杂合外排泵，表明肠杆菌科细菌的TolC基因可在上述细菌间通用。