牛Ⅰ型肽载体(BPepT1)的克隆及在消化道组织中的表达分析

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小肽是蛋白质的重要消化吸收形式的观点已经被广泛接受。在饥饿及某些病理状态下,消化道对游离氨基酸吸收能力减弱或者丧失,以肽结合的形式可以使这些氨基酸得到很好的吸收。小肽的消化道吸收形式包括渗透扩散、中间载体转运和通道穿透吸收三种,其中间载体转运吸收的转运系统与游离氨基酸的转运系统不同,与游离氨基酸的吸收相比,小肽的吸收具有速度快、耗能低、不易饱和等特点。已知的肽载体有两类:PepT1和PepT2,它们在功能、结构和分布上完全不同。PepT1主要分布在消化道,在小肽的消化道吸收中起着重要作用;PepT2主要分布在肾脏,这可能意味着肾脏能够重吸收未被机体充分利用的小肽。兔、人、大鼠、羊PepT1均已被克隆,但对牛的PepT1研究很少,其序列还不清楚。 本试验根据Genebank上登录的人、鼠、兔、羊的核苷酸序列设计引物,扩增牛PepT1的部分编码区,并进行克隆测序。用荧光实时定量RT-PCR方法来研究牛BPepT1在消化道组织中表达水平。结果如下: 1.本试验采用RT-PCR的方法扩增牛PepT1的部分编码区并进行克隆测序(登录号为:DQ309694)。该片段大小为1566bp,经比对该片断是第3结构域—第10结构域之间的片断,与人、鼠、兔、羊、狗、鸡、猪核苷酸的同源性分别为82.89%、80.14%、78.93%、96.04%、83.08%、63.90%、85.66%,氨基酸同源性分别为81.45%、79.62%、76.25%、94.06%、81.49%、61.41%、83.56%。牛、人、鼠、兔、羊、狗、鸡、猪各结构域的氨基酸同源性非常高,均在90%以上。牛、人、鼠、兔、羊、狗、鸡、猪之间,3-4结构域之间的氨基酸同源性为77.63%,4-5结构域之间的氨基酸同源性为98.86%,5-6结构域之间的氨基酸同源性为86.72%,6-7结构域之间的氨基酸同源性为90.13%,7-8结构域之间的氨基酸同源性为91.67%,8-9结构域之间的氨基酸同源性为88.33%,9-10结构域之间的氨基酸同源性为71.74%。9-10结构域之间的序列位于细胞外,对于肽的吸收比较重要,牛PepT19-10结构域之间的氨基酸序列与大鼠、狗、鸡、人、兔子、猪、羊相应序列的同源性依次为65.17%、71.64%、29.38%、67.16%、60.20%、73.13%、88.56%。 2.在整段消化道中,BPepT1的表达量由高到低依次为回肠、空肠、瓣胃、瘤胃十二指肠、网胃、皱胃、盲肠、结肠。各段消化道的BPepT1表达水平差异极显著(P<0.01)。瓣胃的BPepT1表达量与瘤胃差异不显著,与网胃(P<0.05)差异显著,与皱胃(P<0.01)差异极显著;瘤胃BPepT1的表达量有高于网胃(0.05<P<0.15)和皱胃(0.05<P<0.15)的趋势。回肠BPepT1的表达量与空肠差异不显著,回肠和空肠BPepT1的表达量均显著高于十二指肠(P<0.05)、盲肠(P<0.05)和结肠(P<0.05)。回肠和空肠BPepT1的表达量与瓣胃差异不显著;回肠BPepT1的表达量与瘤胃(P<0.05)差异显著,与网胃(P<0.01)、皱胃(P<0.01)差异极显著。空肠与瘤胃差异不显著,与网胃(P<0.01)、皱胃差异极显著(P<0.01)。盲肠、结肠、十二指肠、网胃、皱胃相互之间的差异不显著。牛PepT1与其它动物PepT1具有较高的同源性,以与绵羊PepT1的同源性最高;根据PepT1表达量测定结果,回肠、空肠和瓣胃可能是小肽的主要吸收部位。
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