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研究目的及意义：慢性缺氧引起肺血管收缩的机制十分复杂，尚未完全阐明。缺氧性肺血管收缩有利于使通气不足的肺组织内动脉收缩、血流减少，使肺通气相对充足的肺组织血流增加，从而有利于维持血氧浓度。但肺小动脉持续收缩，肺小动脉肥大、纤维化和肺动脉高压，最终导致右心室扩张，心衰死亡。本研究小组曾首次提出15-HETE可能作为初始因素或非常重要的病理生理介导因子参与缺氧性肺血管收缩，并导致致死性肺动脉高压。15-HETE导致HPV的信号转导通路的阐明对揭示15-HETE引起缺氧性肺血管收缩的分子机制起着不可缺少的极为重要的作用，其结果将有助于揭示肺动脉高压的发病机理，并为研究治疗该进行性，致死性疾病药物提供了可能作用位点。本研究是首次对15-HETE引起肺动脉收缩的信号转导通路进行研究，从分子机制上阐明15-HETE致缺氧性肺血管收缩的中间环节，以全面揭示肺动脉高压的发病机理，并为下一步的研究工作奠定基础。
研究内容及方法：1、复制大鼠缺氧模型，显微分离肺动脉血管环(0.8～1.0mm)在组织浴槽中通过四通道生理记录仪(Medlab6.1)记录分析血管张力变化。比较15-HETE给药前后肺动脉环张力变化；ERK1/2上游激酶抑制剂PD98059和U0126预孵育对15-HETE收缩作用的影响；机械法去除动脉环内皮，再比较15-HETE给药前后肺动脉环张力变化及抑制剂PD98059和U0126对其影响。血管张力数据通过Medlab6.1软件记录分析。2、原代培养大鼠肺动脉平滑肌细胞并经α-actin抗体检测证明是平滑肌细胞。3、采用相应抗体通过Westernblot方法检测细胞裂解总蛋白中磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)。分别分析15-HETE作用时间(5～90min)、15-HETE浓度(10-9～10-6mol/L)、抑制剂PD98059和U0126对ERK1/2的表达及活性的影响。检测缺氧细胞(20min、60min)、正常细胞、缺氧细胞内源性15-HETE对ERK1/2的活性的影响。15-HETE及抑制剂PD98059对重型钙调蛋白结合蛋白(h-caldesmon，h-CaD)磷酸化的影响。4、荧光免疫细胞化学方法分析15-HETE及抑制剂对ERK1/2磷酸化的影响及细胞内定位。5、采用低渗方法提取胞浆蛋白，化学裂解提取胞核蛋白。检测乳酸脱氢酶活性鉴定细胞胞浆与胞核分离效果。分别检测细胞浆与细胞核中15-HETE及抑制剂PD98059对磷酸化ERK1/2及总的ERK1/2含量的影响。6、RT-PCR方法分析抑制剂PD98059对Kv1.5、Kv2.1和Kv3.4mRNA表达的影响。7、免疫共沉淀方法检测15-HETE作用对磷酸化ERK1/2与磷酸化h-CaD结合作用。Westernblot及PCR结果用Quantityone软件测定条带密度。所有数据采用SPSS软件统计处理。
研究结果：1、15-HETE对正常对照组和缺氧组大鼠肺血管环张力的比较，两组动脉环的张力都随15-HETE浓度增加而增强，两组间比较，缺氧组张力增加更明显(P＜0.05)；在15-HETE各浓度10-8、10-7、10-6mom/L，缺氧组动脉环的张力都明显高于对照组(均为P＜0.05)。2、抑制剂PD98059和U0126预孵育，各浓度15-HETE的缩血管作用均明显降低(均为P＜0.05)。3、缺氧肺动脉环去除内皮，15-HETE对去内皮和未去内皮的血管的张力无显著差异(P＞0.05)。4、缺氧肺动脉环去除内皮，再加入PD98059及U0126，15-HETE产生的血管张力均降低(P＜0.05)。5、原代细胞培养大鼠肺动脉血管平滑肌细胞，经α-actin检测鉴定是平滑肌细胞。6、15-HETE作用时间对肺动脉血管平滑肌细胞ERK1/2表达和活性的影响，与对照组(未加15-HETE)比较，10-6mol/L15-HETE作用从5min到48hr对ERK1/2总量没有明显的影响。对ERK1/2活性的影响，以5min作用最明显，随时间延长，15-HETE活化ERK1/2作用降低。与control比较，15-HETE处理5、10、20、30min明显增强p-ERK1/2(P＜0.05)。7、15-HETE浓度对肺动脉血管平滑肌细胞ERK1/2活性的影响，与control比较，15-HETE浓度10-8、10-7、10-6mol/L明显增强p-ERK1/2(P＜0.05)，随15-HETE浓度增大p-ERK1/2增多。8、抑制剂对15-HETE活化ERK1/2的影响，与15-HETE作用比较，PD9805920μmol/L、50μmol/L和U01260.1μmol/L、1μmol/L均能抑制15-HETE对ERK1/2的活化(P＜0.05)，并且抑制剂浓度增大，抑制作用加强。9、荧光免疫细胞化学方法检测15-HETE对ERK1/2的活化，15-HETE组可见磷酸化的ERK1/2呈现的绿色荧光，对照组及抑制剂组无绿色荧光。10、缺氧及缺氧条件下15-HETE对ERK1/2活化的影响，缺氧60min组ERK1/2磷酸化水平比缺氧20min组明显提高(P＜0.05)；在缺氧20min和60min组，15-HETE处理都明显增强ERK1/2的磷酸化(均为P＜0.05)。11、15-LO抑制剂CDC对ERK1/2活化的影响，与control组比较，CDC处理组ERK1/2磷酸化减少(P＜0.05)；用CDC预处理30min再加15-HETE，ERK1/2磷酸化水平明显比没用CDC预处理组ERK1/2磷酸化水平降低(P＜0.05)。缺氧8hrERK1/2的磷酸化显著提高，CDC预处理明显降低ERK1/2的磷酸化水平。12、荧光免疫细胞化学方法检测15-HETE作用的ERK1/2细胞内分布，未用15-HETE处理，总的ERK1/2在细胞浆均匀分布，细胞核内没有ERK1/2；15-HETE处理细胞，总的ERK1/2分布于细胞浆、细胞核，并且细胞核部位及细胞核周围ERK1/2浓集；用PD98059预处理，然后用15-HETE作用细胞，ERK1/2仅分布于细胞浆；15-HETE处理细胞，细胞浆、细胞核都有磷酸化的ERK1/2(如图18)。用PD98059预处理，然后15-HETE作用细胞，检测不到磷酸化的ERK1/2。13、Westernblot方法分析15-HETE作用的ERK1/2细胞内分布，分离胞浆和细胞核蛋白，对照组总的ERK1/2在细胞浆有表达，而在细胞核没有或隐约有表达条带；15-HETE处理细胞，细胞核总的ERK1/2显著增加(P＜0.05)；用PD98059预处理，再加入15-HETE，细胞核总的ERK1/2比15-HETE处理组降低(P＜0.05)。15-HETE明显增强细胞浆和细胞核内磷酸化ERK1/2(均为P＜0.05)；用PD98059预处理，再加入15-HETE，细胞浆和细胞核磷酸化的ERK1/2明显比15-HETE处理组减少(均为P＜0.05)。14、RT-PCR统计结果没有显示Kv1.5、Kv2.1和Kv3.4cDNA在PD98059抑制剂组与15-HETE组之间有差异(均为P＞0.05)。15、检测15-HETE及活化的ERK1/2对下游效应蛋白h-CaD磷酸化作用，Westernblot与免疫共沉淀均显示，与对照组比较，15-HETE明显促进CaD的磷酸化(均为P＜0.05)；抑制剂组与15-HETE组比较，h-CaD的磷酸化明显下降(均为P＜0.05)。
研究结论：1、正常对照组和缺氧组大鼠肺血管环在15-HETE作用下都产生收缩，但以缺氧组肺动脉环收缩更为明显。2、15-HETE经平滑肌ERK1/2通路收缩缺氧大鼠肺动脉。3、15-HETE对肺动脉血管平滑肌细胞ERK1/2表达没有明显的影响。4、15-HETE(外源性)能激活肺动脉血管平滑肌细胞ERK1/2使其磷酸化，呈时间、剂量依赖关系。15-HETE作用时间延长，ERK1/2活性降低；15-HETE浓度增大，ERK1/2活性增强。ERK1/2通路的特异性抑制剂PD98059、U0126抑制15-HETE对ERK1/2的磷酸化。5、15-HETE除能上调正常平滑肌细胞ERK1/2的磷酸化，也能增强缺氧平滑肌细胞ERK1/2的磷酸化。6、内源性15-LO/15-HETE能上调正常和缺氧肺动脉血管平滑肌细胞磷酸化ERK1/2，并且内源性15-LO/15-HETE参与介导缺氧对磷酸化ERK1/2的上调作用。7、15-HETE激活的ERK1/2，其中有一部分由细胞浆进入细胞核，发生核移位。8、RT-PCR方法没有显示15-HETE对Kv1.5、Kv2.1和Kv3.4mRNA的抑制与ERK1/2活化有关。9、15-HETE激活的ERK1/2与h-CaD结合并且磷酸化h-CaD。10、本研究是首次对15-HETE收缩缺氧大鼠肺动脉的信号转导通路开展研究，系统分析了ERK1/2通路的作用，对ERK1/2通路从血管功能上进行定位，从细胞水平和分子水平揭示了15-HETE对ERK1/2的活化，并初步确定了通过h-CaD磷酸化收缩平滑肌，为全面阐明缺氧性肺血管收缩机制提供了数据资料。