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农抗9512-3是一种新型大环内酯类类化合物,是一种高效、低毒、广谱的杀虫抗生素,在农业生产中具有良好的应用,具有广阔的市场前景。本试验对9512-3生产菌株进行了一系列的物理化学诱变并建立了原生质体制备、融合及再生的最佳条件,在此基础上应用基因组重排技术,展开了对农抗9512-3的高产菌种育种工作。
通过对原始菌株进行分离复壮,获得一株遗传性能较为稳定的出发菌株Dor-90(效价204.9ug/ml),经过一系列诱变获得菌株UL-33(高产菌株,效价313.2ug/ml)和D7(长势良好但效价很低),并通过硫酸链霉素和庆大霉素抗性平板筛选,得到了Y34(Str+Gen-)菌株和Z18(Str-Gen+)菌株。
以UL-33为出发菌株进行原生质体制备条件探索,试验结果显示菌株UL-33原生质体制备的最佳条件为250ml三角瓶装有30 ml含0.5%甘氨酸的YEME培养基,孢子悬液接种,28℃,200r/min培养42h;3000r/min收集菌丝体,并用浓度为10.3%蔗糖溶液清洗2次;在溶菌酶浓度为3mg/ml的P缓冲液悬浮菌丝体,30℃下酶解60min,原生质体制备完成。原生质体在PEG1000浓度为40%时,融合率最高。
以Y34(Str+Gen-)、z18(Str-Gen+)、D7(长势良好但效价很低)和AA732(实验室原始保存菌株)为亲本进行基因组重排育种研究,结果显示随着重排的深入,重组群体中高产菌株的出现频率增加。通过连续五轮基因重排,融合效率可达42.1%(趋于稳定)并筛选获得高产菌株F5-41(效价478.5ug/ml),其发酵效价较原始菌株UL-33提高了52.8%,且经过连续五次传代,结果显示该菌株稳定性良好。