线虫抗凝血肽(nematode anticoagulant peptide,NAP)是自犬钩口线虫成虫体内分离得到的一系列具有抗凝作用的小分子多肽类物质,已发现了NAP1、NAPc2、NAPc3、NAPc4、NAP5、NAP6、NAP7等,其中NAPc2和NAP5抗凝活性较强。NAP5含有77个氨基酸,分子量为8.7kD,可直接与凝血因子X/Xa的活性位点结合来抑制其活性,具有丝氨酸蛋白酶抑制作用,可抑制凝血酶原的形成。NAP5在脓毒血症、弥散性血管内凝血(DIC)、膝关节完全置换术后防治静脉血栓塞等急性血小板相关性、静脉血栓的防治和治疗中具有良好的临床应用前景。但NAP5只能抑制凝血酶原产生,对血液中已有凝血酶无作用。水蛭素(hirudin,HV)是从水蛭(Hirodo)唾液腺分泌物中分离出的一种酸性肽,是目前发现的最有效的凝血酶抑制剂,其C端12肽即水蛭素12肽是具有抗凝血酶功能的最小结构片段。它能与纤维蛋白原竞争性地结合凝血酶,抑制凝血酶的活性,阻断纤维蛋白形成,从而防止血栓的形成和发展。水蛭素12肽片段小,抑制凝血酶的活性强,以及几乎无免疫原性,但在体内半衰期短,易降解。为了充分利用这两种抗凝肽的优点,同时弥补他们的不足,将FXa识别序列融合NAP5和水蛭素12肽之间,从而既增强了融合抗凝肽的抗凝功能,又增强了抗凝肽的靶向性。同时将Arg-Gly-Asp(RGD)三肽序列融合在水蛭素12肽C端,以增强抗血小板聚集作用而增加其防治动脉血栓的活性。同时,在目的蛋白N端增加一个6×His Tag以便于蛋白的分离纯化,以期为大量生产抗栓形成的融合蛋白提供有效的基因工程手段。本课题根据设计的融合蛋白氨基酸序列和毕赤酵母的密码子偏好性,设计了八条引物经三轮PCR获得目的基因。将目的基因与毕赤酵母载体pPIC9K质粒重组构建表达质粒,电转化毕赤酵母GS115宿主菌,经G418筛选得到一株表达相对高的阳性克隆,鉴定为甲醇利用快型(Mut+),在摇瓶中实现融合蛋白的高效、稳定和分泌性表达。培养液上清经超滤离心、亲和层析纯化到单一的目的蛋白,经蛋白酶切和Western bloting验证,最终得到1.35mg蛋白。通过抗血小板聚集、凝血酶原时间(PT)、部分凝血酶原时间(APPT)以及蛋白抗凝血酶比活性测定,得到如下结果:融合蛋白在0.10μg/ml时抗血小板聚集活性就基本达到饱和,有很好的抗血小板凝集的活性;随融合蛋白剂量增加,PT,APPT值有增大,且随FXa的加入,PT,APPT值降低,这证明了融合蛋白中NAP5是有活性的;以天然水蛭素为阳性对照,经FXa切割的融合蛋白即水蛭素12肽N端暴露呈活性状态亦具有很好的抗凝血酶活性,这证明了融合蛋白中水蛭素12肽也是有活性的。这验证了本文设计的抗栓形成的融合蛋白。为进一步优化表达条件、分析目的蛋白的功能奠定了基础。