论文部分内容阅读
目的:探讨地尔硫卓(Diltiazem，Dil)对血管紧张素Ⅱ(Ang-Ⅱ)损伤的人脐静脉内皮细胞的保护作用及其可能的机制。 方法:体外培养人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical VeinEndothelial Cells，HUVECs)，用10-6M的Ang-Ⅱ作为损伤因子模拟体外损伤模型，以氯沙坦(Losartan，LT)为阳性药物对照，观察Dil对Ang-Ⅱ损伤的HUVECs的保护作用及其保护作用是否与GHSRIa受体有关。细胞分组:(1)正常对照组;(2) Ang-Ⅱ(10-8M、10-7M、10-6M、10-5M)损伤组;(3) Dil(10-8M、10-7M、10-6M)+Ang-Ⅱ(10-6M)组;(4)[D-Lys3]-GHRP-6(25μM)+Dil(10-6M)+Ang-Ⅱ(10-6M)组;(5) LT(10-6M)+Ang-Ⅱ(10-6M)组;(6) Dil(10-6M)组;(7)[D-Lys3]-GHRP-6(GHSRIa受体选择性阻断剂，25μM)组。细胞贴壁后，随机分组，加GHSRIa阻断剂[D-Lys3]-GHRP-6(25μM)预孵育细胞30min，然后分别加入Dil(10-8M、10-7M、10-6M)及LT(10-6M)处理细胞30min，最后再加入Ang-Ⅱ(10-6M)处理细胞24h。MTT检测HUVECs细胞活力;流式细胞术检测HUVECs凋亡率及HUVECs中活性氧水平;比色法检测细胞培养上清液中NO含量和乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase，LDH)活性;Real time PCR检测HUVECs中eNOS和p47phox mRNA表达;Western blot检测HUVECs中eNOS及p47phox蛋白表达。 结果: 1.各药物对细胞活力的影响:(1)与对照组相比较，Ang-Ⅱ(10-7M、10-6M、10-5M)呈浓度依赖性及时间依赖性降低细胞活力（P＜0.05）; (2)与损伤组(10-6M)相比较，Dil呈浓度依赖性提高细胞活力(P＜0.05)。 2.各药物对细胞凋亡率的影响:(1)与对照组相比较，Ang-Ⅱ呈浓度依赖性增加HUVECs细胞凋亡率(P＜0.05);(2) Dil预处理细胞30min呈浓度依赖性降低细胞凋亡率(P＜0.05);(3)与Dil(10-6M)+Ang-Ⅱ(10-6M)组相比较，[D-Lys3]-GHRP-6(25μM)预孵育细胞30min明显增加细胞凋亡率(P＜0.05)。 3.各药物对细胞产生活性氧的影响:(1) Dil预处理组浓度依赖性降低HUVECs中产生的活性氧（P＜0.05）;(2)与Dil(10-6M)+ Ang-Ⅱ组相比较，[D-Lys3]-GHRP-6(25μM)预孵育细胞30min，细胞活性氧水平显著升高（P＜0.05）。 4.各药物对细胞上清液中NO和LDH释放的影响:(1) Dil预处理组显著增加细胞上清液中NO含量(P＜0.05)，降低LDH活性(P＜0.05);(2)与Dil(10-6M)+Ang-Ⅱ组相比较，[D-Lys3]-GHRP-6(25μM)预孵育细胞30min明显减少细胞上清液中NO含量，增加LDH活性(P＜0.05)。 5.各药物对细胞eNOS mRNA及其蛋白表达的影响:(1) Dil预处理组显著上调细胞eNOS mRNA及其蛋白表达水平（P＜0.05）。(2)与Dil(10-6M)+Ang-Ⅱ(10-6M)组相比较，[D-Lys3]-GHRP-6(25μM)预孵育组明显下调细胞中eNOS mRNA及其蛋白表达水平(P＜0.05)。 6.各药物对细胞p47phox mRNA及其蛋白表达的影响:(1) Dil预处理组下调p47phox mRNA及其蛋白表达水平(P＜0.05);(2)与Dil(10-6M)+Ang-Ⅱ(10-6M)组相比较，[D-Lys3]-GHRP-6(25μM)预孵育细胞30min，显著上调细胞中p47phox mRNA及蛋白表达水平(P＜0.05)。 结论: (1) Dil对Ang-Ⅱ损伤的HUVECs具有保护作用，其保护作用可能与Dil抗氧化性和上调eNOS、NO有关; (2) GHSRIa阻断剂预孵育能够减弱Dil的抗氧化性及下调eNOS、NO; (3) Dil保护Ang-Ⅱ诱导损伤的HUVECs作用可能部分由GHSRIa受体介导。