Foxp是近年来发现的由4个成员组成的F0x亚家族,它们除含有约110个氨基酸组成的FKHDNA结合域外,还含有锌指结构和亮氨酸拉链样结构,并通过形成同源或异源二聚体行使其转录调控功能。在哺乳动物中的最新研究表明,Foxp1可通过转录抑制作用调节T、B细胞的发育,对免疫系统的稳定及其功能发挥具存重要作用；Foxp2是发现的参与人类语言功能实现的首个分子；Foxp3是调节性T淋巴细胞发生、发育以及发挥生物学活性的关键因素,在诱导和维持免疫耐受及免疫抑制功能中具有决定性作用,其表达与否及表达量与抗肿瘤免疫、自身免疫性疾病、抗感染免疫、移植物耐受等的临床转归直接相关；Foxp4参与了肺、神经、肠等组织的发生,同时与T细胞介导的免疫应答具有一定相关性。目前对Foxp亚家族成员的相关研究备受关注。硬骨鱼类是同时拥有天然免疫与特异性免疫的原始脊椎动物,在研究免疫分子的系统进化上占有特殊地位。然而,目前对硬骨鱼类Foxp亚家族成员尚缺乏系统、深入的研究,仅在少数鱼类如斑马鱼、草鱼中有相关报道,并主要对其发育过程中的时空表达模式进行了初步研究。另一方面,越来越多的研究表明,雌激素可通过调节免疫相关分子的表达水平,参与机体的免疫应答调控,最终影响机体的免疫功能。在硬骨鱼中,雌激素是否参与了Foxp亚家族成员的表达调控,目前尚未见报道。罗非鱼(tilapia)隶属鲈形目(Perciformes)丽鱼科(Cichlidae),食性杂,繁殖快,有着巨大的应用价值和市场潜力。然而,目前对罗非鱼免疫方面的相关研究极其匮乏,尚无Foxp亚家族成员的相关研究报道。鉴于此,本研究以罗非鱼(在本研究中,如未特殊说明,罗非鱼均指尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus))为研究对象,一方面通过生物信息学分析与RT-PCR方法相结合,克隆Foxp亚家族成员Foxp1a/1b/2/4的cDNA序列,并对其进行分析；另一方面,对Foxp1a/1b/2/3/4的表达模式、调控因素进行了相关研究,具体研究结果如下：(一) Foxpla/lbFoxp1a开放阅读框全长1710bp,含有15个外显子,编码569个氨基酸；Foxp1b开放阅读框全长2040bp,含有16个外显子,编码679个氨基酸。蛋白序列分析结果显示,Foxp1a与其它脊椎动物有50-55.4%的相似度,Foxp1b与其它脊椎动物有65.7-83.8%的相似度；Foxp1/1b都含有FKH结构域、锌指结构(ZnF_C2H2)及亮氨酸拉链样结构(V-x(6)-L-x(6)-L-x(6)-L),此外,Foxplb还含有可与CtBP1结合的PLNLV超二级结构域。系统进化树和共线性分析结果显示,罗非鱼Foxp1a/1b是哺乳动物Foxp1的直系同源基因,而两种不同亚型Foxp1a/1b可能源于硬骨鱼类特有的基因组复制。qPCR检测罗非鱼Foxp1a/1b在各组织中的mRNA表达水平,结果表明Foxp1a在免疫相关组织中的表达水平明显低于Foxp1b其中Foxp1a在精巢中的表达水平最高,其次是脑、卵巢等；Foxp1b在心脏中表达水平最高,其次是肾脏、肝脏等。不同有丝分裂原PHA、LPS、PMA刺激罗非鱼外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs), qPCR检测刺激不同时间后Foxp1b的表达变化,结果表明,Foxplb在PHA、PMA刺激6h后表达水平显著升高(p<0.05)，12h表达量达到最高,而LPS刺激后则出现先降低后升高的表达变化模式。2×107嗜水气单胞菌腹腔注射成年罗非鱼,结果表明,攻毒6h后肾脏中的Foxp1b表达水平显著上调(p<0.05),24h达到最大,96h恢复到正常水平。从而表明,Foxplb可能参与了淋巴细胞的活化及免疫应答的调节。100ng17β-雌二醇(17p-estradiol, E2)腹腔注射6月龄雄性罗非鱼,48h后qPCR检测Foxp1b表达水平,结果显示,肾脏、肠Foxplb的表达显著上调(p<0.05),而脾脏中的Foxp1b表达显著下调(p<0.05),从而表明,与哺乳动物类似,在硬骨鱼类外源性E2可调控Foxp1b的表达。(二) Foxp2Foxp2开放阅读框全长2298bp,含有16个外显子,编码765个氨基酸。蛋白序列分析结果显示,罗非鱼Foxp2与其它脊椎动物具有高度同源性,相似度达71.5-88.4%,并且含有Foxp亚家族的典型结构域即FKH结构域、锌指结构及亮氨酸拉链样结构。此外,还含有与CtBP1结合的PLNLV超二级结构域。系统进化树和共线性分析结果显示,罗非鱼Foxp2是哺乳动物的直系同源基因。qPCR检测罗非鱼Foxp2组织分布,结果显示Foxp2在脑中的表达水平最高,其次是肌肉、心脏、肾脏等,从而表明,罗非鱼Foxp2可能与哺乳动物类似,主要在中枢神经系统中行使功能。(三) Foxp31. qPCR检测罗非鱼Foxp3的组织分布,结果显示其主要表达于免疫相关组织,其中脾脏中的表达水平最高,其次是头肾、肠、肾脏等。不同有丝分裂原PHA、LPS. PMA刺激罗非鱼PBMCs, qPCR检测刺激不同时间后Foxp3的表达变化,结果表明,当用PHA和LPS刺激,在刺激6h、24h后Foxp3的表达都能显著增强(p<0.05),而用PMA刺激24h Foxp3表达会明显受到抑制(p<0.05)。2×107嗜水气单胞菌腹腔注射成年罗非鱼,结果表明攻毒6h后脾脏组织中的Foxp3表达水平显著下降(p<0.05),一直持续到7d。上述研究结果表明,罗非鱼Foxp3可能与哺乳动物类似,参与了淋巴细胞的活化及免疫应答的调节。2.竞争酶联法与qPCR分别检测6月龄罗非鱼体内不同E2水平对Foxp3表达水平的影响,结果显示,与正常雌性罗非鱼相比,Fadrozole(雌激素合成酶抑制剂)处理组(用每克含400μg Fadrozole的饲料连续饲喂3月龄雌性罗非鱼3个月)血清中E2水平显著降低,与此相应的是,其肠、肾脏中的Foxp3表达水平显著降低；与正常雄性罗非鱼相比,E2处理组(100ng E2腹腔注射6月龄雄性罗非鱼48h后)血清中E2水平显著升高(p<0.05),其肠、肾脏中的Foxp3表达水平显著升高(p<0.05)。从而表明,罗非鱼体内E2水平与Foxp3的表达水平呈明显正相关。3.筛选罗非鱼基因组Fosmid文库,获得Foxp3阳性克隆,通过DNA步移测序及PCR相结合,获得其启动子区序列2266bp；构建了不同长度启动子区的荧光素酶报告基因表达载体,分别命名为pGL3-Foxp3(-2014bp)、pGL3-Fpxp3(-1280bp)及pGL3-Foxp3(-502bp);获得罗非鱼p65cDNA全长1836bp,成功构建p65真核表达载体pcDNA3.1-p65; Foxp3不同长度启动子区荧光素酶报告基因表达载体及pcDNA3.1-p65用Lipofectamine2000转染HEK293细胞；结果显示,pGL3-Foxp3(-1280bp)具有转录活性,而pGL3-Foxp3(-2014bp)及pGL3-Foxp3(-502bp)基本无转录活性,p65对Foxp3启动子的转录活性均无明显的增强效应。(四) Foxp4Foxp4开放阅读框全长2139bp,含有17个外显子,编码712个氨基酸。蛋白序列分析结果显示,罗非鱼Foxp4与其它脊椎动物有66.8-85.8%的相似度,含有FKH结构域、锌指结构及亮氨酸拉链样结构。系统进化树和共线性分析结果显示,罗非鱼Foxp4是哺乳动物的直系同源基因。qPCR检测罗非鱼Foxp4的组织分布,结果显示其在脑中的表达水平最高,其次是心脏、肾脏等。不同有丝分裂原PHA、LPS、PMA刺激罗非鱼PBMCs, qPCR检测刺激不同时间后Foxp4的表达变化,结果表明,用PMA刺激6h Foxp4的表达即显著增强(p<0.05),用LPS刺激24h Foxp4的表达也可增强(p<0.05),而PHA对其表达无影响。2×107活嗜水气单胞菌腹腔注射成年罗非鱼,结果表明,攻毒6h后肾脏中的Foxp4表达水平显著上调(p<0.05),24h达到最大,从而表明,罗非鱼Foxp4可能参与了淋巴细胞的活化及免疫应答的调节。100ng E2腹腔注射6月龄雄性罗非鱼,48h后qPCR检测Foxp4表达水平,结果显示,肾脏、肠Foxp4的表达均显著上调(p<0.05),而脾脏中的Foxp4的表达不受影响,表明在硬骨鱼类外源性E2同样可调控Foxp4的表达。该研究不仅将为Foxp亚家族成员的分子进化等相关研究提供科学数据,而且将推动鱼类分子免疫研究的深入,为鱼类病害的免疫防治奠定基础。