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遗传连锁图谱构建和主要性状QTL分析是植物基因组学研究的重要内容和基础。“农大1号”板栗是通过快中子辐射诱变选育的优良品种,本研究以其无性系1115为母本的半同胞群体为作图群体,利用RAPD标记,围绕板栗分子遗传图谱的构建,进行了板栗基因组DNA提取方法的改进、适用于板栗的RAPD标记体系的建立以及标记的分离分析等方面研究,最终构建了板栗分子遗传图谱,并对其主要性状进行了OTL定位分析。主要结果如下:
1、适合RAPD标记的板栗基因组DNA提取方法板栗组织中富含多酚类、糖类以及单宁类等次生代谢物质,保温时易氧化,因而难以提取比较高质量的DNA,本实验用改良CTAB方法对板栗幼嫩叶片提取DNA,在CTAB溶液中加入抗氧化剂3%PVP和2%β-巯基乙醇,产物的质量可达到实验技术的要求,提取的DNA呈无色透明状,无褐化现象。如需使用成熟叶片提取DNA,可使用加入抗氧化剂3%PVP和2%β-巯基乙醇的3xCTAB,一样可以得到较好的效果。
2、适合遗传图谱构建的RAPD标记技术的建立对影响板栗RAPD各因素逐一设置多个水平进行试验,选出适合其扩增的最优体系和程序如下:20ul反应体系中含有2uL 10×反应缓冲液(200mM Tris-HCl(pH8.4);200mM KCl;100 mM NH4SO4;15mM MgCl2),0.35umol引物,dNTPs各为0.2mM,0.35μM Primer,1.2U TaqDNA聚合酶,10ng模板DNA。94℃预变性5min之后进入循环,每个循环94℃变性30s,37℃退火45s,72℃延伸90 s,维持40个循环。循环结束,72℃延伸7min,4℃ 15 min后取出置于冰箱备用。
3、作图群体RAPD引物筛选及分析对S型随机引物S1-S520 435个,S1001-S2060 420个共855个引物作PCR扩增,进行筛选,从中筛选出带型清晰、具有丰富多态性的93条引物。以这93条引物对群体样品进行RAPD分析,共获得稳定的引物75条,多态性条带195条,平均每个引物可产生2.56条多态性条带。
4、板栗分子遗传图谱的构建应用105个RAPD标记,采用JoinMap(R)3.0作图软件作图,LOD=4.0,卡平方(Chi-square)跳变值≤5.0,板栗半同胞群体遗传图谱分成18个连锁群(Cm1-Cm18,其中Cm3和Cm6因无法确定连锁相,各分成两个片段,实际上是20个连锁群),包含105个标记,图谱总长度841.1cM,标记间平均距离为8.01cM。连锁群Cm1包含的标记最多,有44个标记,最少的连锁群(Cm9-Cm18)只有2个。Cm17的平均图距最大,为43.2cM。Cm1的平均图距最小,为2.3cM。存在15个大于20cM的区间,主要分布在Cm4(2个)、Cm6(2个)、Cm7(2个)、Cm3、Cm8-Cm10、Cm12-Cm17各一个。
5、主要性状QTL连锁定位利用本研究构建的图谱,应用QTL作图软件MapQTL®4.0,采用Kruskal-Wallis单因素方差分析和区间作图法对“农大1号”板栗主要性状进行了QTL定位分析。共检测到105个板栗重要性状的OTL,分布于图谱相对应的18个连锁群上。同类性状的QTL分布都相对集中,如树高和冠幅性状的QTL主要分布在5个连锁群,即Cm1、Cm2、Cm3a、Cm6a、Cm12和Cm18。这种同类性状的QTL相对集中的现象,与同类性状间表型相关比较密切这一结果基本吻合。控制的枝条年生长量、冠幅年生长量和叶片长宽的QTL有不少可单独解释20-60%的表型方差,推测为主效基因,拟进行精细定位,进而进行图位克隆,同时拟进行分子标记辅助育种(MAS),培育出板栗优良品系。