产田麦角碱解脂耶氏酵母菌株的构建和具有乙醛代谢能力的乳杆菌的筛选

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麦角碱是一类可用于治疗头痛和阿茨海默等疾病的化学药物;其中一个重要的中间体田麦角碱主要通过天然产麦角碱菌株发酵获得,其产量受生产菌株培养条件限制一直很低。研究利用基因工程的手段提高田麦角碱产量对于此类药物的开发具有重要意义。  第一部分的研究运用合成生物学技术将田麦角碱生物合成基因依次整合到解脂耶氏酵母中,并通过缺陷型平板筛选和菌落PCR方法对工程菌进行验证;然后运用RT-PCR技术对整合基因的转录水平进行分析;最后对重组菌进行发酵并主要运用UPLC-MS分析发酵液中的产物。主要研究结果如下:  (1)将催化色氨酸生成甲基化二甲基烯丙基色氨酸(Me-DMAT)的基因fgaPT2_Af和fgaMT_Af)整合到解脂耶氏酵母YL002基因组中,成功构建了产Me-DMAT的重组菌HCCB08599。  (2)以HCCB08599为宿主菌,将催化Me-DMAT生成裸麦角碱Ⅰ的基因(oeasE_Aj或去信号肽序列的oeasE_Aj,fgaCat_Af或oeasC_Aj)整合到其基因组中,成功构建了产裸麦碱Ⅰ的重组菌HCCB08601、HCCB08602和HCCB08603,将促进蛋白二硫键形成或核黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)合成有关的基因(pdi1_Sc、ero1_Sc和fad1_Sc)整合到HCCB08602基因组中,得到HCCB08604。研究发现,重组菌中FgaCat酶(fgaCat_Af编码)比EasC酶(oeasC_Aj编码)的活性强,信号肽对EasE酶(oeasE_Aj编码)的功能影响不显著,Pdi1、Fad1和Ero1酶能增强EasE酶的活性。  (3)以HCCB08603为宿主菌,将催化裸麦角碱Ⅰ生成田麦角碱的基因fgaFS_AfoeasA_Cp和fgaDH_Af)整合到其基因组中,得到重组菌HCCB08608。RT-PCR分析相关基因转录水平,发现fgaFS_Af基因不能正常表达,oeasA_Cp和fgaDH_ Af基因正常表达;UPLC-MS分析HCCB08608发酵液,发现其不能合成田麦角碱和裸麦角碱Ⅰ醛。因此,推测构建产田麦角碱重组菌失败的原因有:fgaFS_Af基因不能正常表达,FgaDH酶失活。  乙醛是酒类饮品中的风味物质,但乙醛过高不仅会影响酒类饮品的风味,还会对人体产生潜在的危害。研究如何降低酒类饮品中的乙醛含量具有重要的意义。  第二部分的研究从可食用的益生菌中筛选可以代谢乙醛的菌株,并探究活性菌株的乙醛代谢能力跟乙醇诱导的关系。通过静息细胞法筛选获得的鼠李糖乳杆菌HCCB20591具有较强代谢乙醛的能力,且其代谢能力受乙醇诱导。当乙醇诱导浓度为3%,诱导时间为12h时,乙醛转化率达到41.13%。GC-MS分析其代谢产物除了乙酸外,还生成了乙醇。采用Real time RT-PCR方法分析相关基因的转录水平,发现乙醛代谢是乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶和醛氧化还原酶综合催化作用的结果。
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