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卵巢癌(Ovarian Cancer)死亡率位于妇科恶性肿瘤之首，严重威胁女性的生命健康。由于其发病隐匿、进展迅速，卵巢癌存在“两个70％”:超过70％患者确诊时已属晚期;约70％病人在两年内复发。传统治疗方法为手术联合化疗，在此基础上，免疫治疗及分子靶向治疗为卵巢癌治疗提供了新方向。免疫抑制细胞或因子是阻碍免疫治疗的关键因素，在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。近年来研究发现具有免疫抑制功能的CD8+调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)在前列腺癌、直肠癌、肺癌等恶性肿瘤微环境中的比例显著增高。本实验室前期研究结果表明卵巢癌患者肿瘤组织及外周血中CD8+ Treg比例增高，且卵巢癌细胞生长微环境可诱导具有免疫抑制功能的CD8+ Treg生成，但诱导机制尚不清楚。 转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是一种广泛存在于肿瘤微环境中的多功能细胞因子，可调节细胞增殖分化，抑制免疫功能等。TGF-β1是TGF-β在人体内的主要存在形式。研究发现TGF-β1与Treg诱导增殖分化密切相关。 目的：为探讨TGF-β1是否参与卵巢癌微环境中CD8+ Treg的诱导，本课题主要从以下几方面进行探讨:(1)卵巢癌组织及血浆中TGF-β1的表达，分析其与Treg之间的相关关系;(2)体外共培养实验进一步阐明TGF-β1对卵巢癌微环境中CD8+T细胞表型和功能的影响;(3)基因芯片分析卵巢癌微环境中CD8+T细胞的差异表达基因，阐明TGF-β信号通路在CD8+ Treg诱导过程中的作用。研究结果进一步明确卵巢癌微环境中CD8+ Treg的诱导机制，为卵巢癌的免疫治疗提供新思路。 方法： 免疫组织化学法检测卵巢癌组织，卵巢交界性肿瘤组织和卵巢良性组织中TGF-β1的表达;ELISA法检测卵巢癌，卵巢良性肿瘤和健康体检者血浆中TGF-β1水平;流式细胞术检测卵巢癌患者手术前后外周血CD4+CD25+Foxp3+T、CD8+CD28-T和CD8+Foxp3+T细胞水平;建立健康人CD8+T细胞与卵巢癌细胞系SKOV3体外Transwell共培养体系，实验共设三组: SKOV3与健康人外周血CD8+T细胞共培养组;SKOV3与健康人外周血CD8+T细胞共培养体系中加入anti-TGF-β1中和抗体（中和组）;健康人CD8+T细胞单独培养组。共培养5d后分别收集各组CD8+T细胞和各组共培养上清。ELISA和CBA法检测共培养及单独培养组培养上清中IL-2、IL-10、IFN-γ、TNF-α及TGF-β1的表达水平;流式细胞术检测各组CD8+CD28-T、CD8+CD25+T和CD8+Foxp3+T细胞水平;RT-PCR检测各组CD8+T细胞中IL-2、IL-10、IFN-γ、TNF-α及TGF-β1 mRNA表达水平;3H-TdR法检测各组CD8+T对na(i)ve CD4+T细胞增殖功能的影响;应用Agilent mRNA表达谱芯片分析卵巢癌微环境中CD8+T细胞基因表达的改变，并对差异表达基因进行基因本体(gene ontology，GO)分析和基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路分析;western blot检测MAPK通路相关蛋白（ERK/p-ERK、JNK/p-JNK、P38 MAPK/p-P38 MAPK）在各组CD8+T细胞中表达水平;P38 MAPK特异性抑制剂SB203580预处理CD8+T细胞后，流式细胞术评价各组CD8+CD28-T、CD8+CD25+T和CD8+Foxp3+T细胞水平变化。 结果： 卵巢癌患者肿瘤组织中TGF-β1表达水平明显高于卵巢交界肿瘤组织及卵巢良性肿瘤组织，差异有统计学意义(P＜0.001)，且肿瘤组织TGF-β1的表达水平与肿瘤临床分期及淋巴结转移有关(P＜0.05);而TGF-β1在卵巢交界肿瘤组织及卵巢良性肿瘤组织表达水平无差异(P＞0.05）。与卵巢良性肿瘤及健康对照组相比，卵巢癌患者血浆中TGF-β1表达水平明显增高(P＜0.01);Ⅲ/Ⅳ期卵巢癌患者血浆TGF-β1的表达水平明显高于Ⅰ/Ⅱ期患者（P＜0.05）;与术前相比，术后卵巢癌患者血浆TGF-β1表达水平下降（P＜0.01）。手术后卵巢癌患者外周血CD4+CD25+Foxp3+T、CD8+CD28-T和CD8+Foxp3+T细胞的比例显著低于手术前(P＜0.05);卵巢癌患者CD4+CD25+Foxp3+T、CD8+CD28-T和CD8+Foxp3+T细胞水平与TGF-β1水平存在正相关关系。 与CD8+T细胞单独培养组相比，SKOV3/CD8共培养组上清中高表达TGF-β1(P＜0.01)。在共培养体系中加入anti-TGF-β1中和抗体后，与SKOV3/CD8共培养组相比，anti-TGF-β1中和组CD8+CD28-T、CD8+CD25+T和CD8+Foxp3+T细胞比例下降，但相比CD8+T细胞单独培养组仍然高调;与SKOV3/CD8共培养组相比，anti-TGF-β1中和组CD8+T细胞经anti-CD3，CD28刺激后，TGF-β1、IL-2、IL-10、TNF-α及IFN-γ的表达水平下调(P＜0.05);共培养组CD8+T细胞能抑制na(i)ve CD4+T细胞的增殖，anti-TGF-β1中和组仅在CD8+T细胞和na(i)veCD4+T细胞比例为1∶1时对na(i)ve CD4+T细胞增殖呈现抑制作用，而单独培养组CD8+T细胞不能抑制na(i)ve CD4+T细胞的增殖。Transwell实验显示anti-TGF-β1可部分中和卵巢癌微环境诱导的CD8+Treg表型、抑制性细胞因子水平及抑制功能。 基因芯片结果显示，CD8+T细胞单独培养组与SKOV3/CD8共培养组差异表达基因数为1402，与CD8+T细胞单独培养组比较，SKOV3/CD8共培养组显著上调的基因数有246个(17％)，下调的基因数有1174个(83％);基因本体(GO)分析差异基因主要富集于细胞调节及代谢过程;基因组百科全书(KEGG)通路分析差异基因主要富集于代谢相关通路及MAPK通路;SKOV3与CD8+T细胞共培养后，CD8+T细胞的p-p38 MAPK表达水平显著高于CD8+T细胞单独培养组(P＜0.05)，且增高的p-p38 MAPK水平可被anti-TGF-β1部分中和;p38抑制剂SB203580可抑制卵巢癌微环境中CD8+T细胞向Treg细胞转化，并且呈剂量依赖性。 结论： TGF-β1在卵巢癌微环境CD8+ Treg的诱导过程中发挥重要作用，p-p38MAPK信号通路是其发挥诱导作用的重要通路之一，该通路活化可能是卵巢癌免疫抑制微环境形成和维持的一条重要机制，有利于卵巢癌逃避机体免疫监视，本研究结果为抗肿瘤免疫治疗研究提供了新的思路和方向。