糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy,DPN)是糖尿病最常见的慢性并发症之一,不仅影响患者的生活质量,而且也给社会带来巨大的经济负担。DPN的发病机制尚未完全阐明。高血糖是DPN的一个主要原因,一方面高血糖直接引起神经生化代谢异常、导致信号传递和营养物质转运异常。另一方面高血糖引起血管内皮细胞功能障碍,影响神经氧和营养物质的供给。神经损伤和血管内皮损伤在糖尿病时同时并行存在,导致和加重DPN。 DPN的治疗目前尚无有效的西药,而中医药治疗DPN有悠久的历史,而且在临床上有一定的疗效。治疗方法中主要以益气活血养阴为主,补气药多用黄芪,活血药以丹参为主,益气养阴药中以山药为重。 本研究建立了内皮细胞(Endothelial cells,EC)与雪旺细胞(Schwann cells,SC)共培养模型,从体外研究的角度观察了高糖对与内皮细胞共培养的雪旺细胞的损伤,比较了不同中药及其复方的保护作用。旨在从体外模型、内皮细胞和雪旺细胞相互作用的角度更深入地探讨DPN发病机制及中药的干预作用。 第一部分 高葡萄糖对与内皮细胞共培养的雪旺细胞的损伤 目的：观察高葡萄糖对与内皮细胞(EC)共培养的雪旺细胞(SC)的损伤情况。 方法：建立大鼠SC与EC的共培养模型,根据存活率(形态学和MTT)选定高葡萄糖浓度和作用时间。将细胞分为正常葡萄糖SC与EC共培养组、高葡萄糖SC与EC共培养组及高葡萄糖SC组,通过存活率(形态学和MTT)、凋亡率(流式细胞仪)和凋亡基因Casepase-3mRNA表达(Realtime PCR)观察细胞损伤。 结果：实验形态学及MTT显示,与EC共培养的SC在高葡萄糖条件下,比正常葡萄糖共培养以及高葡萄糖单培养的SC存活率明显下降；SC凋亡率比正常葡萄糖共培养及高葡萄糖单培养的SC明显增高；Casepase-3mRNA表达较正常葡萄糖共培养组明显升高,但与高葡萄糖单培养组相比无显著增高。 结论：高葡萄糖EC与SC共培养模型中,EC的参与加重了SC的损伤。 第二部分 黄芪、丹参、山药及其复方对高糖所致雪旺细胞凋亡的保护作用 目的：观察中药对高糖条件下与内皮细胞(EC)共培养的雪旺细胞(SC)凋亡的干预作用。 方法：建立大鼠SC与EC的共培养模型,根据存活率(形态学和MTT)筛选药物最有效作用浓度。将细胞分为正常共培养SC组、高糖共培养SC组、高糖黄芪组、高糖丹参组、高糖山药组、高糖复方组,通过凋亡率(流式细胞仪)和凋亡相关基因Bcl-2和Casepase-3的mRNA和蛋白的表达(Realtime PCR及WesternBlot)观察细胞损伤。 结果：与正常组相比高糖共培养组SC凋亡率明显增高、Bcl-2mRNA和蛋白表达量明显减少,Casepase-3mRNA和蛋白表达量显著增加。加中药干预后SC凋亡率都明显降低,Bcl-2mRNA和蛋白表达量都明显增加,中药干预组之间比较,高糖复方组增加最显著；高糖丹参组Casepase-3蛋白减少、高糖山药组Casepase-3mRNA减少无明显统计学意义,其余各组Casepase-3mRNA和蛋白表达量均有显著减少,中药干预组之间比较,高糖复方组减少最明显。各中药干预组与正常组相比,SC凋亡率无明显增高,Bcl-2mRNA和蛋白表达量明显减少,Casepase-3mRNA和蛋白表达量显著增加。 结论：中药对高糖环境下与内皮细胞共培养的雪旺细胞的凋亡有保护作用,不同中药作用效果不同,复方效果最佳。