糖尿病是一种由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合症,其基本病理特征为绝对或相对性胰岛素分泌不足所引起的代谢紊乱.作为最重要的降血糖药,胰岛素对胰岛素缺乏的各型糖尿病均有效,具有巨大的市场需求.因此,开发生产胰岛素的新途径、优化现有生产胰岛素的手段一直是医药生物化学领域的一个重要课题.毕赤酵母是近年发展起来的蛋白表达体系,其醇氧化酶基因启动子是诱导型强启动子,可用来调控外源蛋白的表达.该系统具有操作技术简单,可进行高水平的胞内或胞外表达,及对表达产物进行翻译后修饰与加工等显著优点.本课题的目的即是利用基因重组技术构建高效表达胰岛素前体的甲醇毕赤酵母工程菌株,发酵生产人胰岛素. 本文选用巴斯德毕赤酵母GS115菌株为受体菌,分泌型质粒pPIC9K为载体,构建重组质粒pPIC9K::ILP(胰岛素前体),目的基因测序正确后用．Sal Ⅰ线性化,电击法转化GS115菌株.进一步利用重组菌对G418抗性的差异筛选出了具有高外源基因拷贝数的菌株,然后通过摇瓶表达从中筛选得到了一株his+Mut+表型的高表达菌株,并成功地在5 L罐和16 L罐上进行了发酵.通过HPLC检测发酵上清发现该重组酵母菌株能高效表达和分泌胰岛素前体.随着诱导时间的延长,胰岛素前体的表达量随之增加,5 L和16 L罐上的表达量分别为2.6g/L和3.6 g/L.发酵液经阳离子交换层析得到胰岛素前体,进一步用胰蛋白酶转肽获得了高纯度的重组人胰岛素,转肽效率达87％.HPLC分析与质谱分析结果都证明最终获得了人胰岛素.利用小鼠降血糖实验测得该重组人胰岛素的体内活性为28.8 U/mg,与天然人胰岛素活性相当,证明所设计的胰岛素前体基因在毕赤酵母中获得了高表达,表达的胰岛素前体可以被正确的加工和折叠. 本文还建立了一套完整的基因工程毕赤酵母发酵表达胰岛素前体后经加工得到人胰岛素的制备工艺.