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目的:本研究通过观察内源性基因RFK表达上调和表达下调的两种形式,对RFK与缺血性脑损伤的关系进行了研究,并对其抑制神经元缺血时的内质网应激通路机制和通过外源性补充核黄素对RFK基因功能低下的补偿作用进行了研究。第一部分构建RFK慢病毒载体方法:(1)以鼠RFK原始c DNA为模板,进行PCR扩增。用p Lenti6.3-IRES2-EGFP/V5DEST系列质粒载体构建包含RFK的过表达载体,同时以Lenti-EGFP质粒载体构建成空病毒载体。(2)首先构建真核载体pc DNA,选择3个靶点设计3组si RNA干扰序列,连接转化鉴定。将制备好的3组si RNA干扰序列载体转染C6细胞,提取总RNA及总蛋白。应用q PCR和Western Blotting技术对si RNA干扰前后C6细胞的RFK表达进行分析,筛选最佳针对RFK基因的si RNA干扰序列。然后以最佳干扰序列的质粒载体为模板扩增并构建到p Lenti6.3-MCS/V5 DEST系列质粒载体,构建成干扰RFK表达慢病毒载体。将所得RFK过表达慢病毒载体、空病毒载体和干扰RFK表达慢病毒载体感染293T细胞,检测病毒滴度。再应用PCR和Western Blotting检测转染RFK过表达载体和干扰RFK表达慢病毒载体大鼠脑皮层的RFK表达情况。结果:(1)对照组中神经元无荧光,Vehicle组与LV-RFK组中神经元均含有大量的荧光,空病毒载体与RFK过表达慢病毒载体包装成功。与Vehicle组相比,q PCR结果LV-RFK组的RFK的m RNA表达显著升高(约5.7倍);Western Blotting结果LV-RFK组的RFK蛋白表达量是Vehicle组的1.6倍(P<0.01),表明RFK过表达慢病毒载体构建成功。(2)sh-RFK组的293T细胞生长状态良好,而且绝大部分细胞发出绿色荧光,表明GFP的表达呈阳性,干扰RFK表达慢病毒载体包装成功。Western Blotting结果sh-RFK组的RFK蛋白表达量是阴性组0.7倍(P<0.01),表明干扰RFK表达慢病毒载体构建成功。第二部分RFK抗缺血性脑损伤的作用机制将实验大鼠脑皮层转染慢病毒载体21d,制备大脑中动脉梗塞(MCAO)模型;离体神经元感染慢病毒载体12h,培养2-3天,制备缺糖缺氧(OGD)模型。实验分为5组:对照组、模型组、Vehicle(空病毒载体)组、LV-RFK(RFK过表达慢病毒载体)组和sh-RFK(干扰RFK慢病毒载体)组。方法:1.RFK抑制缺血性脑损伤(1)利用称重法,检测大鼠脑水肿。(2)利用TTC染色技术,检测大鼠脑梗死面积。(3)取大鼠脑梗死灶附近皮层和OGD模型后神经元,电镜观察细胞形态学变化。(4)MTT法检测离体神经元细胞活性。(5)利用流式细胞仪检测离体神经元细胞凋亡。通过检测以上指标,分析RFK与缺血性脑损伤的关系。2.RFK抗缺血性脑损伤的作用机制(1)采用Western Blotting技术检测Ero1、CHOP和Caspase家族凋亡相关蛋白表达情况。(2)外源性加入Ero1的抑制剂Erodoxin,MTT法检测细胞活性情况。(3)采用3月龄SHR-SP大鼠,核黄素组大鼠饮水以含有核黄素的水替代,观察各组大鼠自然死亡时间。(4)去除核黄素,利用流式细胞仪检测细胞凋亡及MTT法检测细胞活性。补充核黄素、FMN和FAD,检测RFK表达下调时神经元细胞活性与凋亡的情况。结果:1.RFK抑制缺血性脑损伤(1)与对照组相比,模型组、Vehicle组、LV-RFK组大鼠脑组织重量显著增加(P<0.01);LV-RFK组大鼠脑组织重量轻于Vehicle组(P<0.01)。提示MCAO手术导致大鼠脑组织水肿,而RFK表达上调对MCAO诱导的脑水肿有一定的抑制作用。(2)LV-RFK组较Vehicle组的脑梗死面积显著减少(P<0.01)。提示RFK表达上调抑制脑缺血后缺血周围脑组织坏死,从而抑制缺血脑损伤。(3)Vehicle组大鼠脑皮层细胞突触泡扩大,线粒体有空泡;sh-RFK组大鼠脑皮层细胞突触泡极度扩张,线粒体极度肿胀;LV-RFK组大鼠脑皮层细胞结构基本正常。Vehicle组细胞线粒体肿胀,线粒体少数膜断裂,突触泡内容物消失;sh-RFK组细胞基质淡,突触泡极度扩张,突触泡前后膜分离,内质网扩张;LV-RFK组细胞结构基本正常。结果表明RFK表达上调对大鼠脑损伤及原代培养的神经元具有保护作用,而RFK表达下调则加重大鼠脑损伤及原代培养的神经元细胞损伤。(4)相较于Vehicle组,LV-RFK组细胞活性显著增加(P<0.01),sh-RFK组细胞活性显著降低(P<0.05)。从细胞活性方面证明上述结论。(5)相较于Vehicle组,LV-RFK组细胞坏死率显著增加(P<0.01),sh-RFK细胞坏死率显著降低(P<0.01)。从细胞凋亡方面证明上述结论。2.RFK抗缺血性脑损伤的作用机制(1)实验大鼠未经过MCAO手术时,与Vehicle组相比,LV-RFK组与sh-RFK组的Ero1、Caspase12和Caspase3表达水平无变化;但LV-RFK组的CHOP表达量显著降低(P<0.01)。实验大鼠经过MCAO手术时,与Vehicle组相比,LV-RFK组的CHOP(P<0.01)和Caspase3(P<0.01)表达量显著降低;sh-RFK组的Caspase12(P<0.01)和Caspase3(P<0.01)表达量显著升高;而LV-RFK组与sh-RFK组的Ero1表达水平无变化。结果表明RFK会影响内质网应激相关蛋白中的CHOP、Caspase12和Caspase3蛋白表达情况,但不影响Ero1蛋白表达情况。(2)与Vehicle组相比,未加入Erodoxin的LV-RFK组活性显著增加(P<0.01),已加入Erodoxin的LV-RFK组活性显著降低(P<0.01)。说明RFK抗缺血性神经元损伤的作用依赖于黄素蛋白Ero1。(3)与对照组相比,核黄素组大鼠寿命显著延长(P<0.05)。表明全寿命内补充核黄素能显著延长RFK基因功能低下的SHR-SP大鼠寿命。(4)无核黄素时,LV-RFK组细胞活性显著升高(P<0.01);有核黄素时,RFK表达对神经元的保护作用有增强的趋势;RFK表达下调的神经元活性较无核黄素时有增强的趋势。无核黄素时,LV-RFK神经元坏死率仍然低于Vehicle组(P<0.05),但坏死率较有核黄素的LV-RFK组增多(P<0.01)。结果均说明RFK的保护作用不依赖于核黄素,补充核黄素对RFK功能低下有一定的补偿作用。(5)与Vehicle组相比,sh-RFK组细胞活性显著降低(P<0.01);与sh-RFK组相比,补充核黄素(P<0.01)、FMN(P<0.01)、FAD(P<0.01)组细胞活性均显著增加。与Vehicle组相比,sh-RFK组细胞坏死率显著增高(P<0.01);与sh-RFK组相比,补充核黄素组(P<0.01)、FMN组(P<0.05)、FAD组(P<0.01)细胞坏死率均显著降低。表明补充核黄素、FMN、FAD能在一定程度上保护细胞,但不能完全逆转RFK表达下调引起的的神经元损伤。结论:1、RFK基因过表达慢病毒载体与干扰RFK基因表达慢病毒载体构建成功,成功转染293T细胞或神经元,有效上调和下调大鼠神经元中RFK基因的表达。2、RFK基因功能低下明显增加脑卒中易感性,RFK是抗缺血性脑损伤的内源性蛋白。3、RFK抗缺血性脑损伤作用机制包括抑制ERS引起的细胞凋亡途经,包括抑制CHOP和Caspase12信号通路,而且RFK的保护作用依赖于黄素蛋白Ero1。4、RFK抗缺血性损伤的保护作用不完全依赖于核黄素,但补充核黄素能部分补偿RFK基因功能低下引起的损伤。