研究背景随着癌症诊断和治疗水平的提高,癌症患者的生存期也越来越长。然而,癌症伴随的疼痛已成为世界关注的公共卫生问题,严重影响着患者的生活质量。乳腺癌和前列腺癌常发生骨转移,发生率高达70%～90%。肿瘤骨转移可导致骨折、高钙血症、脊髓压迫和疼痛等症状,其后果往往是灾难性的。骨癌痛(BCP)是一种常见的中重度疼痛,折磨着约75%的晚期癌症患者。BCP是一种复杂的疼痛状态,临床症状包括持续隐痛、自发痛和运动诱发痛。自发痛和运动诱发痛常被称为“爆发痛(breakthrough pain)”,特点为突发突止的剧烈疼痛。这使得常规的镇痛药物很难有效控制爆发痛。并且,大剂量镇痛药物如阿片类药物的使用可能导致严重副作用。BCP治疗困难的根本原因在于其发病机制尚未完全阐明。因此,进一步探究BCP的发病机制,寻找治疗BCP的新靶点或新药物至关重要。慢性痛的形成,引起了背根神经节、脊髓背角和疼痛相关脑区的多种基因表达发生改变,其产物可以长时程地、稳定地调控慢性痛产生所需要的神经可塑性。表观遗传调控通常是指DNA核苷酸序列不变的情况下,基因表达活性发生了可遗传的变化,主要包括:DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA调控等。大量的研究表明BCP发生发展中和表观遗传调控关系密切。沉默调节蛋白1(SIRT1)是Sirtuin家族中的一员,为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶。基础实验表明,SIRT1在代谢性疾病、衰老和肿瘤的进展中发挥重要调控作用。近年来,SIRT1在慢性痛中的作用也备受关注。BCP大鼠模型中,鞘内注射SIRT1激活剂SRT1720可以通过抑制线粒体动力相关蛋白1(Drp1)介导的线粒体分裂减轻BCP。然而,BCP发生发展过程中,脊髓SIRT1的表达及酶活性如何变化尚不清楚。谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统的重要兴奋性神经递质,通过多种离子通道型和代谢型受体发挥作用。代谢型谷氨酸受体(mGluRs)广泛分布于脊髓中,并且在调控伤害性刺激信息的传递中起重要作用。八种mGluRs根据序列一致性、药理学特性和信号传导分成三组。Ⅰ组mGluRs(mGluR1和mGluR5)主要与磷脂酶C(PLC)偶联,而 Ⅱ 组(mGluR2和mGluR3)和Ⅲ组(mGluR4,6,7,8)负偶联与腺苷酸环化酶(AC)。既往研究证实,抑制Ⅰ组mGluRs(mGluR1/5)可以缓解BCP。此外,最近的一项研究显示,糖尿病性神经病理性痛模型中,脊髓SIRT1通过表观遗传调控mGluR1/5表达缓解大鼠的痛觉过敏。因此,我们提出假设:激活脊髓SIRT1通过抑制mGluR1/5表达减轻BCP。本研究拟通过建立BCP小鼠模型,探索脊髓SIRT1在BCP中的作用及其机制,为临床治疗BCP提供新的思路和方法。本研究分为两个部分,第一部分:BCP小鼠模型中脊髓SIRT1表达的变化;第二部分:激活脊髓SIRT1通过抑制mGluR1/5的表达缓解BCP。研究目的第一部分:检测BCP小鼠脊髓水平SIRT1酶活性、蛋白及其mRNA表达的变化,明确脊髓SIRT1在BCP发生发展中的作用。第二部分:探索激活脊髓SIRT1对BCP小鼠痛行为学和脊髓mGluR1/5表达的影响,部分阐明SIRT1在BCP中的作用机制,为其临床治疗提供新的思路和方法。研究方法第一部分:小鼠纤维肉瘤细胞株NCTC 2472细胞培养于含10%马血清的NCTC 135培养基中,按照美国菌种保藏中心(ATCC)推荐的方法进行培养。选择超清洁级健康雄性C3H/HeN小鼠,4～6周龄,体重20～25 g。采用股骨远端骨髓腔接种NCTC 2472细胞的方法建立BCP小鼠模型。将40只小鼠随机分为假手术组(Sham组)和BCP组(n=20)。于接种前(0d),接种后4、7、10、14和21 d时,每组随机取8只小鼠固定进行痛行为学检测。痛行为学检测包括机械缩足反应阈(PWMT)和自发抬足次数(NSF)。于接种后7、14和21 d时,每组随机取6只小鼠,深麻醉后处死取其脊髓L3-5节段。分别采用荧光法、Western blot和Real-time PCR技术检测小鼠脊髓水平SIRT1酶活性、蛋白及其mRNA的表达。于接种后21 d时,每组取1只小鼠的右侧股骨进行组织学检测,显微镜下观察肿瘤细胞的浸润和骨质破坏情况。第二部分:本部分研究包括两项实验:(1)实验一:鞘内注射SIRT1特异性激活剂SRT1720对BCP小鼠痛行为学和脊髓mGluR1/5表达的影响;(2)实验二:鞘内注射SIRT1腺相关病毒干扰RNA(AAV-SIRT1-shRNA)对正常小鼠痛行为学和脊髓mGluR1/5表达的影响。实验一:48只小鼠随机分为四组(n=12),即Sham组、BCP组、二甲基亚砜(DMSO)组和SRT1720组。于接种后14 d时开始进行鞘内注射,连续3天。DMSO组和SRT1720组分别鞘内注射20%DMSO和5 μg SRT1720(溶解于20%DMSO),容量均为5 μl。于鞘内给药后1d时,各组随机取6只小鼠,深麻醉后处死取其脊髓L3-5节段。分别采用荧光法、Western blot和Real-time PCR技术检测小鼠脊髓水平SIRT1酶活性,SIRT1和mGluR1/5蛋白及其mRNA的表达。于鞘内给药后1、2、3和4d时,各组剩余的6只小鼠进行痛行为学检测。实验二:18只小鼠随机分为三组(n=6),即正常小鼠组(Naive组)、AAV-GFP control组和SIRT1 shRNA组。AAV-GFP control组和SIRT1 shRNA组分别鞘内注射AAV-GFP(阴性对照)和AAV-SIRT1-shRNA,容量均为5μ1。于鞘内给药后21d时,各组进行痛行为学检测。随后,深麻醉下处死小鼠,取其脊髓L3-5节段。分别采用荧光法、Western blot和Real-time PCR技术检测小鼠脊髓水平SIRT1酶活性,SIRT1和mGluR 1/5蛋白及其mRN A的表达。结果第一部分:痛行为学结果显示,与接种前比较,Sham组小鼠于接种后4 d时PWMT降低,NSF增加;BCP组小鼠于接种后4、7、10、14和21 d时PWMT降低,NSF增加(P<0.05)。与Sham组比较,BCP组小鼠于接种后7、10、14和21 d时PWMT降低,NSF增加(P<0.01)。小鼠右侧股骨组织学结果显示,接种后21 d时,BCP组出现明显的肿瘤细胞浸润和骨质破坏,而Sham组小鼠骨质结构未见明显异常。与Sham组比较,BCP组小鼠接种后7、14和21 d时脊髓水平SIRT1蛋白及其mRNA表达下调,酶活性降低(P<0.01)。第二部分:实验一:与Sham组比较,BCP和DMSO组小鼠脊髓SIRT1蛋白及其mRNA表达下调,酶活性降低(P<0.01);与BCP组比较,SRT1720组小鼠脊髓SIRT1蛋白及其mRNA表达上调,酶活性增加(P<0.01)。行为学结果显示,与Sham组比较,BCP和DMSO组小鼠鞘内给药后1-4 d时PWMT降低,NSF增加(P<0.01);与BCP组比较,SRT1720组小鼠鞘内给药后1-3 d时PWMT 增加,NSF 降低(P<0.05)。与Sham组比较,BCP和DMSO组小鼠脊髓mGluR1/5蛋白及其mRNA表达上调(P<0.01);与BCP组比较,SRT1720组小鼠脊髓mGluR1/5蛋白及其mRNA表达下调(P<0.01)。实验二:与Naive组比较,AAV-GFP control组小鼠脊髓SIRT1酶活性、蛋白及其mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05);SIRT1 shRNA组小鼠脊髓SIRT1蛋白及其mRNA表达下调,酶活性降低(P<0.01)。行为学结果显示,与Naive组比较,AAV-GFP control组小鼠PWMT和NSF差异无统计意义(P>0.05);SIRT1 shRNA 组小鼠 PWMT 降低,NSF 增加(P<0.01)。与Naive组比较,AAV-GFP control组小鼠脊髓mGluR1/5蛋白及其mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05);SIRT1 shRNA组小鼠脊髓mGluR1/5蛋白及其mRNA表达上调(P<0.01)。结论第一部分:脊髓SIRT1参与了 BCP的形成与维持。第二部分:激活脊髓SIRT1通过抑制mGluR1/5的表达缓解BCP。