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铁作为许多功能蛋白的重要辅助因子,对于植物的生长发育起着极其重要的作用。在人类中,缺铁是引起人类贫血症的主要原因之一,而植物性食物是人类获得铁的主要来源,因此研究植物体内铁的吸收,转运以及调控的机制是非常重要的。bHLH38/39/100/101是四个调控拟南芥缺铁响应的重要基因,但它们是如何被缺铁信号激活的还不清楚。为此,我们以bHLH101的启动子为诱饵进行酵母单杂交实验。通过筛选,我们鉴定到一个bHLH蛋白,bHLH34,它可以直接结合到bHLH101的启动子上。进一步分析发现,bHLH34的同源蛋白bHLH104也可以结合到bHLH101的启动子上。这暗示bHLH34和bHLH104可能也参与植物的缺铁响应调控。为了证实我们的推测,我们从拟南芥种质资源中心获得了bHLH34和bHLH104两个基因的T-DNA插入突变体,通过RT-PCR鉴定,两个突变体都是缺失突变体。考虑到bHLH34和bHLH 104可能存在功能冗余性,我们又通过杂交构建了bhlh34bhlh104双突变体。表型分析发现,在缺铁条件下,bhlh34,bhlh104单突变体和bhlh34bhlh104双突变体都表现出了典型的缺铁症状,即叶子的黄化和根的生长抑制现象,其中bhlh34bhlh104双突变体的缺铁症状最为严重。为了进一步验证bHLH34和bHLH104的功能,我们设计了一个人工microRNA,amiR-bhlh34/104,它可以同时特异性的靶向bHLH34和bHLH104两个基因。我们构建了amiR-bhlh34/104转基因植株,发现转基因植株在缺铁条件下也表现出了典型的缺铁症状,其表型与bhlh34bhlh104双突变体类似,这说明amiR-bhlh34/104转基因植株模拟了bhlh34bhlh104双突变体的表型。铁还原酶活性的升高是植物缺铁的一个典型指标,因此我们检测了野生型和突变体的铁还原酶活性。在缺铁条件下,野生型植株和突变体的铁还原酶活性都显著升高,但是突变体的铁还原酶活性远低于野生型,而且bhlh34bhlh104双突变体的铁还原酶活性最低。铁含量检测表明,无论在铁充足还是铁缺少的情况下,bhlh34bhlh104双突变体根和叶的铁含量都显著低于野生型。为了揭示bHLH34和bHLH 104的分子调控机制,我们分析了缺铁响应基因的表达情况。铁吸收直接相关的两个基因IRT1和FRO2以及正调控植物缺铁响应的转录因子MYB10, MYB72,bHLH38/39/100/101和FIT在突变体中都下调。这说明bHLH34和bHLH 104正调控缺铁响应。为了证实是否提高bHLH34和bHLH104的表达水平可以促进铁的吸收,我们构建了bHLH34和bHLH104的高表达转基因植株。大约10%的bHLH34高表达株系和33%的bHLH104高表达株系表现出植株矮小,老叶坏死的症状,而其余株系则没有明显表型。进一步分析发现,高表达株系积累了高水平的铁含量,并且大幅上调了缺铁响应基因的表达,这说明bHLH34和bHLH104的确是正调控缺铁响应的。酵母单杂交实验表明bHLH101可能是bHLH34和bHLH104的直接靶基因。bHLH38/39/100是bHLH101的同源基因,并且它们都受到缺铁环境的强烈诱导,因此,我们猜测bHLH38/39/100/101可能都受到bHLH34和bHLH104的直接调控。为了证实该猜想,我们设计了一个effector-reporter瞬时表达系统。将bHLH38/39/100/101的启动子分别与含有核定位信号的GFP融合作为reporter,将bHLH34或bHLH104与CaMV35S启动子融合作为effector。瞬时共表达实验结果表明,bHLH34和bHLH104可以特异性地激活bHLH38/39/100/101的启动子,但不能激活FIT的启动子。这说明bHLH38/39/100/101都是bHLH34和bHLH104的靶基因。通过在bhlh34bhlh104双突变体的背景下高表达bHLH101,我们发现bhlh34bhlh104双突变体的缺铁症状得到了明显的缓解。基因表达分析发现,这些转基因植株中IRT1和FR02的表达比bhlh34bhlh104双突变体显著提高,说明bHLH101的高表达可以部分互补bhlh34bhlh104双突变体的表型。酵母双杂交实验,双分子荧光互补实验及免疫共沉淀实验同时证明了bHLH34和bHLH104可以互作形成异源二聚体。另外,我们又进一步通过酵母双杂交实验证实bHLH34, bHLH104和bHLH105任意两者之间都可以形成异源二聚体,它们也都可以与自身形成同源二聚体。为了进一步阐释这三个基因的关系,我们构建了两个双突变体bhlh34bhlh105和bhlh104bhlh105。我们发现bhlh34bhlh104,bhlh34bhlh105和bhlh104bhlh105三种双突变体的表型比bhlh34, bhlh104和bhlh105三种单突变体中任何一个的表型都更加严重,说明bHLH34, bHLH104和bHLH105这三个基因的功能是相互叠加的,而不是冗余的。此外,我们也观察到ProbHLH34:GUS, ProbHLH104:GUS和ProbHLH105:GUS在根和下胚轴具有不同的表达模式,这也许可以解释它们功能上的非冗余性。我们的工作表明bHLH34和bHLH104转录因子通过介导bHLH38/39/100/101基因的转录从而正调控拟南芥的缺铁响应,并且增加bHLH34和bHLH104的表达水平足以提高植物的铁含量,这也为通过基因工程方法提高农作物的铁含量提供了一个新思路。