论文部分内容阅读
目前生物固氮，主要还是依靠传统意义上的手段，通过固氮微生物进行固氮。而较少研究通过分子克隆手段，让植物本身具有固氮能力。因此将固氮基因转入植物，并得到表达，使之具有固氮能力，生产上具有重要的意义，并有较大的经济价值。
本实验当中，通过农杆菌GV3101，将新型固氮基因nifT44成功导入烟草中，并得到表达，还具有较大的固氮功能。通过PCR，SDS-PAGE，RT-PCR，GFP绿色荧光蛋白观察及无氮培养基培养等手段，对转基因烟草进行检测，证实获得了新型固氮基因的转基因烟草植株。再通过15N示踪法，进行15N丰度测定，筛选出了固氮能力较强的转基因烟草。本实验的主要研究结果如下：
(1)本研究中，初步建立了转基因烟草的组织培养体系，和转化体系。转基因烟草用0.1％的升汞浸泡8分钟时，可以获得最佳的消毒效果。侵染液农杆菌的OD590值为0.5、添加20μg／mL的AS、侵染时间为8min、共培养2天时，可以获得最高的转化效率。并筛选出了相关抗生素的最佳使用浓度：50μg／mL潮霉素，50μg／mL的卡那霉素，300μg／mL的头孢霉素，和50μg／mL的利福平。
(2)通过农杆菌GV3101介导法，将新型固氮基因成功导入烟草（中烟90），并成功得到表达，并具有大的固氮能力。由此可见，农杆菌GV3101对于烟草转基因来说，是合适菌株。
(3)通过常规分子生物学方法PCR，SDS-PAGE，RT-PCR，GFP绿色荧光蛋白观察，和通过无氮或极微量培养基培养，证实获得了转基因烟草植株，并初步证实了转基因烟草植株具有固氮能力。
(4)15N测定结果表明：本实验获得了成功，转基因烟草的固氮能力很强。它体内的15N丰度，是其它对照植株的4.3倍之多。通过无氮培养基培养转基因烟草，发现其在低氮情况下仍能正常生长。通过15N示踪法，让转基因烟草在充满15N的环境下生长一段时间，从植物体内检测出高含量的15N，证明转基因烟草能转化利用空气中的氮元素，固氮基因已成功转入烟草植株中。证明本实验培养出的转基因烟草具有较高的科学、经济价值。