第1章 bFGF基因扩增及真核表达载体pcDNA3.1(+)-bVGV 的构建研究。 目的：用PCR法从现有pDONR-bFGF质粒中扩增bFGF基因序列，构建重组pcDNA3.1(+)-bFGF质粒并大量制备，为下一步在离体和活体实验研究bFGF对RIB的保护作用奠定基础。 方法：根据bFGF的DNA序列设计并合成特异性引物，并在其上下游引入EcoRI和NotI两个酶切位点及保护碱基，Taq酶作用下采用PCR法扩增bFGF基因片段，并与线性化后的pcDNA3.1(+)在连接酶作用下进行重组。双酶切鉴定后转染感受态DH5a大肠杆菌，鉴定后大量制备。 结果： 1.bFGF基因片段扩增：从pDONR-bFGF经PCR反应，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，得到465bp左右的的特异性条带。 2. 重组的pcDNA3.1(+)-bFGF质粒，经EcoR Ⅰ、NotⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳显示得到两个大小分别为465bp和5.4kb的片断。 第2章放射线诱导的C17.2神经干细胞损伤及bFGF基因转染后的保护作用研究。 目的：建立离体C17.2 NSC损伤模型，以pcDNA3.1(+)-bFGF质粒转染NSC为基因修饰手段，研究其放射耐受性，观察bFGF转基因治疗放射性神经细胞损伤的作用。 方法：采用nestin免疫细胞化学鉴定C17.2 NSC。将pcDNA3.1(+)-bFGF质粒通过脂质体法转染C17.2 NSC，采用原位杂交、免疫细胞化学和Western blot法检测bFGF在C17.2 NSC的表达。流式细胞仪观察放射后早期凋亡，Hoechst33258观察凋亡形态，MTT法测细胞活性并拟合生存曲线，研究bFGF在离体细胞水平对放射性损伤的保护作用。 结果: 1.NSC的培养和鉴定：免疫细胞化学染色显示95﹪NSC呈Nestin阳性染色。 2.bFGF基因在C17.2 NSC的表达重组bFGF转染C17.2 NSC后24h，免疫组化与原位杂交显示在C17.2 NSC胞浆中有bFGFmRNA转录和蛋白表达。Western Blot可检测到转染的C17.2 NSC中有bFGF蛋白，而未转bFGF的C17.2 NSC中无bFGF蛋白存在。 3.C17.2 NSC照射后凋亡及bFGF的作用经Hoechst33258染色后荧光显微镜观察到未经放射处理的C17.2 NSC中未见凋亡现象，经放射处理后C17.2 NSC有大量的凋亡细胞，并可见少量凋亡小体，而转染重组pcDNA-bFGF的C17.2 NSC中凋亡细胞少。 流式细胞仪分析结果显示：未转染质粒对照组和转染pcDNA3.1(+)组在2Gy和6Gy剂量放射后，凋亡率和死亡率相近，均较未照射组高(P<0.05)；转染pcDNA3.1(+)-bFGF质粒后，C17.2 NSC在2Gy和6Gy剂量放射后凋亡率和死亡率均低于前两组(P<0.05)；转染pcDNA3.1(+)-bFGF质粒组在8Gy照射后仍可存活，未转染质粒对照组和转染pcDNA3.1(+)组照射8Gy后大片死亡。 4.NSC放射后生存曲线对照组和转染空质粒组两组生存分数没有差异，合并为C17.2组按一组计算，转染bFGF组单独计算；两条生存曲线中实测值与方程预计值的相关性均为r=0.96。C17.2组α/β值为0.159/0.038Gy，bFGF组为0.09/0.088Gy，C17.2组DO为0.98Gy，bFGF组为2.03Gy，SF2值，C17.2组为0.58，bFGF组为0.64。 重组的bFGF可转染C17.2 NSC，重组bFGF转染的NSC稳定表达bFGF。bFGF可增强C17.2 NSC的放射抵抗力，对辐射引起的NSC损伤具有保护作用。 第3章 RIB大鼠模型建立和放射后行为学、组织病理学、BBB通透性的定量分析研究. 目的:建立RIB大鼠模型。观察不同放射剂量条件下RIB鼠学习记忆能力下降情况，了解组织病理学特点、突触超微结构改变情况，并定量分析BBB通透性改变。 方法:对各组实验大鼠采用直线加速器给以不同放射剂量的照射，然后利用Morris水迷宫为工具，检测RIB鼠在不同放射剂量下学习记忆能力。组织病理学HE染色观察各组病理变化特点，透射电镜观察海马突触超微结构变化。干一湿重法和伊文氏兰法检测放射后BBB通透性。 结果: 1、SD大鼠放射性脑损伤模型制备采用直线加速器给以不同放射剂量照射，与临床RIB发生的病理生理状态接近，各组大鼠照射后生存生长良好，无瘫痪、抽搐及异常神经反射出现。 2、RIB模型鼠水迷宫实验检测学习、记忆能力5组大鼠照射前平均寻台潜伏期、路径长度和搜索策略均没有差异(P>0.05)；分别给以假放射对照、10Gy、20Gy、30ay和40Gy不同剂量照射后，组间比较5组平均寻台潜伏期间存在差异(P<0.05)；组内比较20Gy、30 Gy和40Gy比对照组和10 Gy组平均潜伏期长(P<0.05)。放射后7d、20d、60d不同时间点之间没有差异(P>0.05)。各组大鼠4个时间点总路径长度，随着放射剂量的增加而逐步增加(P<0.05)；各组大鼠在不同时间点，目标象限路径长度与总路径长度的百分比，随着放射剂量增大而缩短(P<0.05)表明放射线照射对大鼠学习记忆能力有影响，并且与放射剂量正相关。 3、HE染色情况对照组、10Gy和20Gy照射组放射后1W未见明显病理变化；30Gy和40Gy组可见海马和皮层神经元轻度变性，胞核染色质浓集，胞体萎缩，胞浆红染，细胞有空泡变性现象发生。白质区域较对照组呈现组织结构梳松、脑组织内血管扩张和血管周隙扩大等表现；40Gy组较30Gy组上述病变稍重。 4、海马突触超微结构参数的测量照射组大鼠比对照组突触活性带长度短，突触界面曲率小，突触间隙宽度变窄，PSD厚度变薄，均有统计学意义(P<0.05)；除PSD厚度外其它指标30Gy照射组与20Gy照射组之间也存在不同(P<0.05)。表明放射可造成突触结构破坏，且与剂量正相关。 5、干－湿重法和伊文氏蓝法定量检测血脑屏障通透性干－湿重法检测脑组织含水量放射后比放射前增加(P<0.05)，放射后2d、7d、20d和60d各组脑含水量没有差异(P>0.05)；伊文氏蓝法检测，放射后EB含量比放射前高(P<0.05)，放射后2d、7d、20d和60d各组间EB含量也有差异(P<0.05)，表明EB法在测定RIB模型鼠BBB通透性上，较干－湿重法更为敏感。 第4章侧脑室注射pcDNA3.1(+)-bFGF质粒对RIB模型鼠的保护作用研究。 目的：观察侧脑室注射重组pcDNA3.1(+)-bFGF质粒对RIB的保护作用，了解bFGF转基因治疗后模型鼠脑内星形胶质细胞的变化和GFAP的表达情况及Vimcntin－mRNA的水平，并探讨在对RIB模型鼠的保护中的作用。 方法：对RIB模型鼠分组后分别侧脑室注射pcDNA3.1(+)-bFGF和pcDNA3.1(+)空质粒，并设生理盐水对照组，观察注射后模型鼠脑组织病理学情况、学习记忆能力和BBB通透性的变化，同时免疫组化法观察星形胶质细胞数量的变化和GFAP表达的强度，RT-PCR法测Vimentin-mRNA表达水平。 结果： 1、行为学检测情况Morris水迷宫测验结果表明，转染pcDNA3.1(+)-bFG组模型鼠平均寻台潜伏期明显短于注射pcDNA3.1(+)空质粒组和注射NS组，路径总长度也短于注射空质粒组和注射NS组(P<0.05)。 2、质粒注射后海马突触TPSD结果突触超微结构观察表明，注射pcDNA3.1(+)-bFGF组TPSD大于其它三组(P<0.05)。 3、质粒注射后BBB通透性定量检定各组大鼠EB法检测BBB通透性结果显示：注射后20d测得pcDNA3.1(+)-bFGF组脑组织EB含量为34.57±7.3μg/g，空质粒组为75.8±9.4 μg/g，NS组为72.6±8.7 μg/g，注射pcDNA3.1(+)一bFGF组脑组织EB含量低于其它两组(P<0.05)。 4、免疫组化检测GFAP阳性细胞的表达和HE染色情况注射质粒20d后GFAP的表达以注射pcDNA3.1(+)-bFGF组为最多，注射空质粒和NS组相似，对照组最少，差异均有统计意义(P<0.05)。60d后再次检测RIB模型鼠bFGF治疗组，GFAP阳性细胞数多于对照组，但较20d时为少(P<0.05)；GFAP表达阳性灰度20d时放射后各组均比对照组高(P<0.05)，以注射pcDNA3.1(+)-bFGF组最为明显(P<0.01)；60d时结果相似。HE染色可见pcDNA3.1(+)-bFGF组上述放射后组织病理学改变减轻。 5、RT-PCR法检测vimentin-mRNA表达各组vimentin-mRNA的RT-PCR产物凝胶电泳后对比分析，20d时注射空质粒组和NS组结果相似，为4组中最高，注射pcDNA3.1(+)-bFGF组高于对照组(P<0.05)。提示放射可以引起vimentin-mRNA表达增高，注射pcDNA3.1(+)-bFGF质粒可以从转录水平降低vimentin-mRNA的产生，60d时各组vimentin-mRNA没有差异(P>0.05)。