拟南芥NAD补救合成途径尼克酸糖基化在种子逆境萌发过程中的功能及进化机制研究

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NAD+和其衍生物NADP+是生物体内重要的辅酶,参与超过1800个氧化还原反应,在代谢网络中起着至关重要的作用。最新研究表明,NAD除了具有氧化还原反应辅酶的生理功能外,它还可以作为一些酶促反应的底物,通常NAD在这些反应中会被消耗释放出尼克酰胺(Nicotinamide,NIM)和以ADP-核糖(ADP-ribose)为母体结构的化合物。在拟南芥体内,尼克酰胺通过一个四步的补救途径重新生成NAD。  我们之前发现当用14C-NIM饲喂拟南芥组织时,有大量的尼克酸(Nicotinate,NA)及其衍生物在体内积累,包括两种结构未知的尼克酸衍生物。在本研究中,我们首先利用LC-qTOF-MS初步确定这两种尼克酸衍生物都是其糖基化的形式:尼克酸羧酸位糖基化化合物(Nicotinate O-glucoside,NAOG)和尼克酸N-位糖基化化合物(Nicotinate N-glucoside,NANG)。进一步的饲喂试验表明这两种NA糖基化产物的积累模式呈现组织特异性。我们通过综合利用拟南芥基因组序列信息、酶学活性-基因表达关联分析的方法确定了编码尼克酸糖基转移酶的候选基因。原核表达、蛋白纯化和体外酶活鉴定表明在拟南芥基因组中尼克酸羧酸位糖基转移酶由UGT74F2编码,N位糖基转移酶是由UGT76C4和UGT76C5编码。拟南芥相关突变体,过表达及互补植株的14C-NIM饲喂结果进一步确证三个基因在植物体内生物学功能:催化尼克酸的糖基化反应。  实时定量PCR分析发现UGT74F2和UGT76C4在干种子中高表达,随着种子萌发而下降,暗示NA的糖基化可能参与种子萌发生理过程。我们通过种子萌发的生理实验证明,尼克酸羧酸位置糖基化在逆境条件下的种子萌发过程中发挥重要的功能,表现为UGT74F2的突变体(74f2)在含有125mM NaCl和500mM Mannitol的琼脂平板上萌发时萌发率的下降,过表达UGT74F2能够恢复这一表型,同时我们还发现N位糖基转移酶只能部分恢复74f2萌发率的下降。此外该株系在含有100μM NIM和100 mM NaCl的琼脂平板上萌发时表现种子萌发率下降的叠加效应(与单独100mM NaCl处理相比,Col-0和74f2种子萌发率差异从36%上升到56%),说明74f2萌发率的下降可能是由于体内NA的过度积累造成的。  我们利用LC-QQQ-MS定量测定上述株系的种子在各种条件下萌发过程中尼克酸及其衍生物的含量变化。化学分析结果表明NAD和NaMN在各个株系的突变体中没有明显变化。在74f2突变体中,与野生型相比随着NA的含量显著上升,而且74F2过表达可以恢复这些化合物变化的表型。在不同逆境条件下种子萌发过程中,74f2突变体中的NA含量则比野生型高出四倍,进一步说明突变体74f2种子萌发率的下降是由于体内NA过度积累造成的。  由于NAOG是首次在植物中报道,我们进一步研究该化合物在植物界中的分布,饲喂试验表明NAOG是一类十字花科植物特异的代谢物。通过对琴叶拟南芥(A.lyrata)、芥菜(C.rubella)、盐芥(T.halophile)和白菜(B.rapa)UGT74F亚家族的同源基因进行异源表达和体外酶活鉴定,从分子层面证明了NAOG的十字花科植物特异。我们还探索了NA两种糖基化产物的化学稳定性和分泌的差别,发现NANG化学性质更加稳定(不易被β-糖苷酶水解),容易被分泌到植物体外(>20%),而NAOG则更容易被糖基水解酶水解,重新用于NAD生物合成,因而NAOG可能是一种NA的暂时储存形式。  基于以上结果我们认为NA的两种糖基化修饰对于拟南芥的生理作用是有所差别的,两种糖基化修饰都是在某种特定的生长条件下消除尼克酸对植物细胞的“内源压力”,而从能量利用的角度上讲NAOG比NANG具有更多的选择优势,这也可能是NAOG在十字花科植物特异性存在的原因。两种NA糖基转移酶基因的功能鉴定也为我们进一步研究十字花科植物中NA修饰的多样性奠定了基础。
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