目的:中药分子鉴定是在传统鉴定方法上,基于分子生物学技术开发出来的一种新型鉴定方法,可通过直接分析遗传物质的多态性来推断物种内在的遗传变异从而实现药材鉴定。该方法从基因水平上提供一种鉴别依据,不受外界因素、生物发育阶段或器官组织差异的影响,可以抛开形态相似的假象,还能避免化学特征的过于多变,因此具有鉴别位点多,结果可靠,分辨率高等优点。中药分子鉴定不仅易找到种级的鉴定特征,甚至可以进行种下等级的鉴定。快速、简便、现场化一直是中药分子鉴别的追求。然而,目前的分子鉴定方法操作过程较为复杂繁琐,耗费时间较长,需要多种大型贵重仪器,无法实现现场快速鉴别。为实现中药现场快速鉴别,黄璐琦科研团队提出了一种利用碱裂解DNA提取法、快速PCR扩增法等进行分子鉴定的中药现场快速分子鉴别体系,并对金银花等中药进行了应用,但仍存在DNA提取时间长、检测过程繁琐等问题。名贵中药是品种问题混乱的高发区。铁皮石斛(Dendrobium ofifcinale Kimura et Migo)属兰科石斛属,俗称铁皮兰、黑节草,是我国传统名贵中药。由于石斛属植物种间、种内形态相似、分布范围广泛、杂交品种众多,市场上常出现质量参差不齐的石斛类药材及其混伪品,导致其用药质量和安全难以保证。使用传统鉴定方法难以达到高效的石斛类药材的真伪鉴别目的,因此急需建立快速准确的铁皮石斛专属分子鉴别方法。虽然有研究使用AFLP、RAPD、SSR、多重PCR等技术,从分子水平上鉴别铁皮石斛及其伪品,但这些分子鉴别方法均包含DNA提取、核酸扩增、电泳检测等过程,操作复杂,不仅需要大量贵重仪器,且鉴别时间较长,只能在实验室中由专业人员操作检测,均未能实现快速鉴别的目的。基于以上事实,本研究以铁皮石斛为例,探索建立一种更加高效的中药材现场快速分子鉴别体系,分别从提取、扩增、检测三方面进行方法学优化,以简化操作步骤,缩短鉴别时间。通过研究,为实现中药材野外、现场鉴别提供技术支持,为中药质量控制的现代化提供参考。方法:1.DNA提取:使用常规定性滤纸作为核酸吸附的载体,通过裂解液的裂解,释放核酸并吸附在滤纸上,利用洗脱液进行核酸纯化,即可不到30 s完成整个核酸提取过程,吸附核酸的滤纸可直接放入反应体系进行扩增。2.石斛属样品分类学研究:利用性状、显微等常规鉴别方法,观察确定了样品来源的正确性,并针对收集到的30余种石斛属样品进行分类学研究。3.利用环介导等温扩增技术(LAMP)鉴别铁皮石斛:以核基因编码间区ITS为靶基因,根据铁皮石斛与其近缘种变异位点设计特异性LAMP引物,并引入一处错配,通过优化反应条件,对铁皮石斛及其近缘物种样品进行扩增和检测,65℃,40min内结束恒温反应,通过肉眼直接观察产物荧光变化来判断结果。4.将DNA快速提取方法与环介导等温扩增技术结合,建立铁皮石斛现场快速分子检测方法,可在40min左右完成整个鉴别过程。结果:1.建立了一种无设备快速30 s提取中药材DNA的方法,即中药材DNA滤纸提取法,可以在30s成功提取不同药用部位,不同样品类型的中药材核酸。经扩增验证,可获得与传统提取方法相一致的检测结果。2.建立了基于环介导等温扩增的铁皮石斛特异性分子鉴定方法,该方法能够在40 min内完成检测,可通过肉眼直接观察产物荧光变化来判断结果。经验证,能够区分铁皮石斛及其近缘种,有较好的特异性。3.建立了铁皮石斛野外现场快速鉴别方法,将30s快速DNA滤纸提取法与铁皮石斛LAMP快速扩增及检测技术结合,并进行了铁皮石斛快速检测试剂盒的开发设计。4.建立了中药材现场快速检测SOP。结论:本研究通过滤纸法快速提取核酸、铁皮石斛LAMP快速扩增技术,基本解决了铁皮石斛分子鉴别中操作复杂,检测时间长等问题。建立了一种快速、简便、现场化、特异性强的铁皮石斛分子鉴别方法。研究结果为铁皮石斛等中药现场快速分子鉴别体系的建立提供了参考。