第一部分 炎症细胞因子/趋化因子在新生大鼠肾缺血再灌注损伤致急性肺损伤的表达及作用目的:探讨炎症相关细胞因子/趋化因子在新生大鼠肾缺血再灌注(I/R)损伤诱导ALI中的表达及其作用。方法:采用生后10天的Sprague-Dawley(SD)雄性新生大鼠并随机分为三组(正常对照组、假手术组、实验组)。实验组为I/R组,进一步分为双肾结扎45min再灌注1h、3h、6h、12h、24h和48h;假手术组(Sham组)只暴露双肾45min不结扎,仅做24h;正常对照组(Control组)不做任何处理。收集大鼠双侧肾、肺组织和血。利用自动生化分析仪检测大鼠血肌酐(sCr)水平,HE染色观察肾和肺组织病理变化并进行病理损伤评分。采用多功能液相芯片技术检测27种炎症细胞因子/趋化因子在各组大鼠肾、肺组织和血清中的蛋白表达水平,包括干扰素诱导蛋白10(CXCL10)、表皮生长因子(EGF)、嗜酸细胞活化趋化因子(Eotaxin)、趋化因子CX3C配体1(Fractalkine)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、趋化因子C-C基元配体1(GRO/KC/CINC-1)、白细胞介素类(IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-17A、IL-18)、γ-干扰素(IFN-γ)、瘦素(Leptin)、受激活调节正常T细胞表达和分泌因子(RANTES)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)、巨噬细胞炎性蛋白-2(MIP-2)、受激活调节正常T细胞表达和分泌因子(RANTES)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和血管内皮生长因子(VEGF),并筛选出在肾I/R早期升高且组间变化趋势较明显的细胞因子/趋化因子,进一步实时定量PCR(qRT-PCR)验证该细胞因子/趋化因子mRNA的表达。结果:1.成功建立AKI诱导ALI新生大鼠模型:I/R各组大鼠的sCr水平随再灌注时间的延长呈先升高后降低的趋势,sCr在I/R3h开始升高,I/R24h达到高峰,I/R48h下降。HE染色显示,I/R24h和48h组肾和肺组织均可见明显病理损伤改变,I/R 24h和48h的肾和肺病理损伤评分均明显高于Control组水平(P<0.001);肾组织I/R 48h组损伤比24h组轻,病理评分差异具有统计学意义(P<0.05);而肺组织I/R 48h组损伤比24h组严重,病理评分差异也具有统计学意义(P<0.001)。2.炎症细胞因子/趋化因子在肾I/R大鼠肾、肺组织和血清中的蛋白表达:多功能液相芯片检测结果显示,各组大鼠肾组织中,与Control组相比,I/R 3h表达水平升高明显的为IL-10、VEGF(P<0.05);与Sham组相比,I/R3h升高水平有统计学意义的为CXCL10、IFN-γ和IL-6(P<0.05);随着再灌注时间的延长,I/R组间变化差异显著且组内差异较小的有CXCL10和IL-10(P<0.001)。在肺组织中,与Control组比较,I/R3h升高水平明显的有EGF、MIP-1α(P<0.05);与Sham组相比,I/R3h升高水平有统计学意义的为IL-4、VEGF(P<0.05);进一步I/R组间比较,随着再灌注时间的延长,组间差异显著且组内差异较小的有CXCL10、IL-6、IL-10、MCP-1(P<0.001)。血清中可检测到 CXCL10、Fractalkine、IL-5、IL-12p70、IL-18、LIX、MCP-1、RANTES的表达,随着再灌注时间延长,组间变化显著且组内差异较小的为IL-5、IL-18、LIX、MCP-1(P<0.05)。3.肾、肺组织和血清中CXCL10和IL-10的蛋白表达:肾和肺组织中CXCL10的蛋白表达水平均呈先升高后下降的趋势,I/R3h升高,I/R12h达到高峰,I/R24h恢复至Control组水平。与Control组和Sham组相比,两种组织I/R6h和12h组水平升高均具有统计学意义(P<0.05);血清CXCL10表达水平也呈先升高后下降的趋势,I/R 3h升高,I/R 6h达到峰值,I/R 12h降至接近Control组水平,但是组间比较无明显差异(P>0.05)。肾和肺组织中IL-10的表达水平均在I/R 3h最高,随着再灌注时间的延长,IL-10的表达水平呈下降趋势,到I/R24h恢复至Control组水平。与Control组和Sham组比较,两种组织中I/R3h、6h和12h升高水平均具有明显差异(P<0.05);血清IL-10浓度未检测到。4.肾和肺组织CXCL10 mRNA的表达:qRT-PCR结果显示,肾和肺组织Sham组的CXCL10 mRNA表达水平与Control组无明显差别(P>0.05)。与Control组相比,CXCL10 mRNA在肾组织I/R 1h就表达上调(P<0.001),而在肺组织I/R 12h才表达上调(P<0.05),两种组织CXCL10 mRNA在I/R24h的表达水平均明显高于I/R其他组(P<0.001)。结论:1.肾缺血再灌注损伤可以诱导新生大鼠急性肺损伤。2.趋化因子CXCL10在肾缺血再灌注大鼠的肾、肺组织和血清中均早期明显升高,且肾组织CXCL10 mRNA表达水平上调早于肺组织,提示CXCL10在新生大鼠肾缺血再灌注损伤诱导急性肺损伤中起重要作用。第二部分 尿CXCL10与危重患儿急性肾损伤、肺损伤及预后的相关性研究目的:第一部分动物实验结果提示,趋化因子CXCL10在大鼠AKI及ALI中均发挥重要作用。本研究旨在探讨uCXCL10与危重患儿AKI、ALI及预后的关系。方法:选择2016年9月至2016年12月入住本院重症监护病房(PICU)的危重患儿为研究对象进行前瞻性研究。记录危重患儿入PICU时的一般情况,入住PICU期间脓毒症、AKI、ALI、多器官功能障碍综合征(MODS)、休克和弥散性血管内凝血(DIC)发生情况及尿量情况;住PICU期间机械通气(MV)、血液净化以及药物应用情况;住PICU时间、住院期间MV时长、总住院时间及病死率。评估危重患儿入PICU首个24h第三代儿童死亡风险(PRISM Ⅲ)评分。动态采集危重患儿住PICU 1周内的尿液标本,酶联免疫吸附法(ELISA)测定uCXCL10水平,选择第一次uCXCL10和入PICU 1周内最大uCXCL10水平进行研究。AKI诊断标准:符合以下任意条件之一即可诊断:①血肌酐值(sCr)48h内升高≥26.5μmol/L;②7天内升至基线值的1.5倍以上;③尿量小于0.5ml/kg/h持续超过6小时。AKI分为AKI 1期、AKI 2期和AKI 3期。ARDS诊断依据2015年制定的《儿童急性呼吸窘迫综合征:儿童急性肺损伤会议共识推荐》标准。根据住PICU 7天内AKI发生情况分为非AKI组、轻度AKI(AKI 1期)组、重度AKI(AKI 2期和3期)组;根据住PICU期间是否发生 ARDS、是否行 MV,分为 MV/ARDS(ARDS 和/或 MV)组与 non-(MV/ARDS)(非ARDS且非MV)组;根据住院期间是否发生死亡分为死亡组和存活组。采用Spearman检验分析uCXCL10与临床指标的关系,广义线性模型分析uCXCL10与AKI和ARDS等临床指标的相关性,多因素Logistic回归分析评估在校正混杂因素后uCXCL10与病死率的关系,受试者工作特征(ROC)曲线及曲线下面积(AUC)评估uCXCL10对危重患儿病死率的预测价值。结果:1.研究共纳入123例危重患儿,有35例(28.5%)危重患儿发生AKI,其中轻度AKI(AKI 1期)12例(9.76%),重度AKI(AKI 2期14例和AKI 3期9例)23例(18.70%),ARDS 14例(11.38%),MV54例(43.90%),MV/ARDS 57例(46.34%),死亡15例(12.20%)。AKI三组患儿间uCXCL10水平比较,差别无统计学意义(P>0.05),重度AKI组患儿最大uCXCL10水平明显高于非AKI组(P=0.026)。MV/ARDS组患儿第一次和最大uCXCL10水平均显著高于non-(MV/ARDS)患儿(第一次:P=0.032;最大:P<0.001)。Spearman相关性分析显示,第一次和最大uCXCL10水平与危重患儿年龄、PRISM Ⅲ评分、脓毒症、MODS、DIC、MV、MV/ARDS、病死率均相关(P<0.05)。除此之外,最大uCXCL10水平还与重度AKI、ARDS、MV持续时间相关(P<0.05)。脓毒症患儿第一次和最大uCXCL10水平也均显著高于非脓毒症患儿(第一次:P=0.001;最大:P<0.001)。2.广义线性模型分析结果显示,在校正混杂因素后,第一次uCXCL10与脓毒症(OR:1.478,95%CI:1.012-2.157,P=0.043)和 MODS(OR:1.860,95%CI:1.193-2.900,P=0.006)相关。最大 uCXCL10与 PRISM Ⅲ 评分(OR:1.021,95%CI:1.001-1.040,P=0.039)和脓毒症(OR:1.646,95%CI:1.127-2.406,P=0.010)相关。3.123例危重患儿中,死亡组第一次和最大uCXCL10均明显高于存活组(P均<0.001)。多因素Logistic回归分析显示,在校正年龄、体重和PRISM Ⅲ评分后,最大 uCXCL10水平仍与病死率显著相关(OR:7.926,95%CI:1.706-36.817,P=0.008)。第一次和最大uCXCL10预测危重患儿发生死亡的AUC值分别为0.771(95%CI:0.66-0.88,P=0.001)和 0.859(95%CI:0.78-0.94,P<0.001)。PRISM Ⅲ 评分预测患儿发生死亡的 AUC 值为 0.856(95%CI:0.76-0.95,P<0.001)。结论:1.最大uCXCL10水平与重度AKI和ALI相关,在校正混杂因素后,第一次uCXCL10与MODS相关,最大uCXCL10与脓毒症和PRISM Ⅲ评分相关。2.第一次和最大uCXCL10对危重患儿的死亡均有重要预测价值,其中最大uCXCL10对危重患儿病死率的预测价值与PRISM Ⅲ评分接近。