论文部分内容阅读
第一部分：解偶联蛋白2在高游离脂肪酸所致的胰岛α细胞分泌功能异常中的作用目的：探讨高游离脂肪酸(FFA)对体外培养的胰岛α细胞胰高糖素分泌功能变化及抑制解偶联蛋白2(UCP2)表达对胰高糖素分泌功能的影响。方法：体外培养胰岛α细胞系TC1-6细胞,分别应用正常培养基、加用棕榈酸和／或UCP2抑制剂genipin进行培养,测定比较各组胰高糖素分泌、细胞胰高糖素含量及胰高糖素1nRNA表达。采用RNA干扰技术,以特异性siRNA抑制UCP2表达,分别测定正常培养、加用棕榈酸和／或抑制UCP2表达后各组胰高糖素分泌、细胞胰高糖素含量及胰高糖素表达情况。结果：1.棕榈酸培养刺激TC1-6细胞胰高糖素分泌显著增加,而在此基础上应用genipin或si-UCP2抑制UCP2,可使增加的胰高糖素水平下降。2.棕榈酸培养并应用genipin或si-UCP2对TC1-6细胞胰高糖素含量及mRNA表达无明显影响。3.正常培养的TC1-6细胞,应用siRNA抑制UCP2表达后胰高糖素分泌也明显降低,提示UCP2也参与正常α细胞分泌功能维持。结论：UCP2参与高水平FFA所致的胰岛α细胞异常分泌,但不影响胰高糖素合成。UCP2对维持正常α细胞分泌功能也有一定作用。第二部分：解偶联蛋白2调节的氧化应激在高游离脂肪酸所致的α细胞分泌功能异常中的作用目的：了解高FFA体外培养的胰岛α细胞氧化应激状态、细胞内Ca2+水平,及UCP2对其影响。方法：体外培养胰岛α细胞系TC1-6细胞,分别应用正常培养基、棕榈酸及genipin或si-UCP2进行培养,采用实时定量PCR和、western blot则定UCP2及对其表达有调控作用的过氧化物酶体增殖物活化受体γ协同刺激因子-la(PGC-la) mRNA和蛋白水平表达。采用ELISA方法测定各组培养基上清液硝基酪氨酸(NT)水平。荧光标记细胞内Ca2+,流式细胞仪分别测定正常培养、加用棕榈酸及抑制UCP2表达并应用棕榈酸培养细胞平均荧光强度(MFI),以反映细胞内Ca2+水平。结果：1.棕榈酸刺激UCP2表达,genipin抑制UCP2水平,而si-UCP2能够更有效抑制UCP2表达,棕榈酸对抑制后的UCP2仍有刺激作用,抑制后未达正常培养抑制后的低水平。2.棕榈酸刺激PGC.1α水平上升,genipin能够在一定程度抑制其表达,应用siRNA抑制UCP2对PGC-la表达影响不大。3.加用棕榈酸培养使NT水平上升,genipin对其影响不大,siRNA抑制UCP2表达后加用棕榈酸NT水平进一步升高,提示UCP2参与氧化应激状态的调节。4.短期应用棕榈酸使荧光标记的细胞内Ca2+水平上升,抑制UCP2表达后加用棕榈酸细胞内Ca2+水平低于前者。结论：高FFA刺激α细胞氧化应激水平增强,UCP2参与调控氧化应激,但在对α细胞功能影响过程中,其对氧化应激的抑制作用不是主要方面。FFA和UCP2对细胞内Ca2+浓度的影响可能与其影响α细胞分泌有关。第三部分：解偶联蛋白2对胰岛IDE细胞胰岛素信号通路的影响目的：探讨高FFA对体外培养的胰岛α细胞胰岛素信号通路的影响及UCP2在其中的作用。方法：体外培养胰岛α细胞系TC1-6细胞,测定分别正常培养、加用棕榈酸及si-UCP2培养后胰岛素诱导的IRS-1磷酸化水平。在有无棕榈酸背景分别加入胰岛素、磷脂酰肌醇3-激酶(P13-K)抑制剂wortmannin及genipin,测定各组的胰高糖素分泌情况。并用western blotting检测各组胰岛素信号转导下游分子Akt的磷酸化情况。结果：1.胰岛素诱导IRS-1磷酸化,但与正常培养相比棕榈酸组IRS-1磷酸化明显受到抑制,而在棕榈酸加si-UCP2组其抑制作用有所减弱。2.胰高糖素分泌结果显示,应用棕榈酸组胰高糖素分泌普遍高于未加棕榈酸培养组,在未加棕榈酸的各个亚组中,应用胰岛素明显抑制胰高糖素分泌,而加用wortmannin减弱该作用；genipin组胰高糖素分泌略低于正常,而同时应用胰岛素和／或wortmannin无明显差别；在加用棕榈酸的各亚组,应用胰岛素对胰高糖素分泌有抑制,但未达显著差异,在此基础上应用wortmannin,能够阻断胰岛素作用。3.胰岛素诱导Akt磷酸化结果显示,应用胰岛素的亚组Akt磷酸化水平普遍高于未用胰岛素的亚组；wortmannin能够阻断胰岛素作用,在胰岛素的基础上再给予wortmannin,胰岛素诱导的Akt磷酸化水平下降；应用棕榈酸组胰岛素诱导的Akt磷酸化升高水平低于未用棕榈酸组,且应用wortmannin后棕榈酸组对胰岛素诱导的Akt磷酸化抑制率低于无棕榈酸组,提示FFA对Akt磷酸化有抑制作用；在棕榈酸基础上加用genipin,可在一定程度上减轻FFA对胰岛素诱导的Akt磷酸化的抑制作用,提示UCP2对P13-K通路有一定抑制作用,并可能参与了FFA的抑制作用。结论：FFA抑制IRS-1及Akt磷酸化,抑制UCP2对FFA所致的胰岛素信号通路转导障碍有所改善,并且可能与其影响α细胞分泌功能有关。