论文部分内容阅读
目的:研究雌二醇(Estradiol,E2)对HEC-1A子宫内膜癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,以及E2对细胞鞘氨醇激酶(sphingosine kinase,SphK)的激活效应,GPER/SphK/ERK1/2通路激活促进HEC-1A细胞增殖、迁移及侵袭的相关机制。方法:一、雌二醇对HEC-1A细胞增殖、迁移和侵袭的影响1.E2对HEC-1A细胞增殖的作用采用MTT方法检测不同浓度的雌二醇(E2)作用于HEC-1A子宫内膜癌细胞不同时间后,对细胞增殖的影响。实验分组:(1)空白对照组(Ctrl组);(2)1×10~-99 M的E2处理组;(3)1×10~-88 M的E2处理组;(4)1×10~-77 M的E2处理组;(5)1×10~-66 M的E2处理组;(6)1×10~-55 M的E2处理组。检测E2处理细胞24小时、48小时、72小时之后细胞增殖情况。2.E2对HEC-1A细胞迁移的作用采用划痕实验检测1×10~-77 M的E2作用于细胞不同时间后,对细胞迁移的影响。实验分组:(1)空白对照组;(2)E2处理组。检测E2处理细胞24小时、48小时、72小时之后细胞迁移情况。3.E2对HEC-1A细胞侵袭的作用采用transwell实验检测1×10~-77 M的E2作用于细胞48小时后,对细胞侵袭的影响。实验分组:(1)空白对照组;(2)E2处理组。二、GPER/SphK介导雌二醇的非转录效应激活ERK1/2通路1.HEC-1A细胞中SphK1/2的表达情况采用Western blot方法检测1×10~-77 M的E2处理细胞24小时、48小时、72小时之后细胞中SphK1和SphK2的蛋白表达情况。2.SphK的活性变化使用SphK活性测定试剂盒检测在不同时间点(0,5,15,30,60 min)1×10~-77 M的E2对细胞SphK活性的影响。然后使用GPER阻断剂G-15(5μM)预处理细胞30 min后,给予E2处理15 min后检测SphK的活性,分组如下:(1)空白对照组;(2)E2处理组;(3)G-15组;(4)G-15+E2组。3.ERK1/2的磷酸化变化采用Western blot方法检测在不同时间点(0,5,15,30,60,120 min)1×10~-77 M的E2对细胞ERK1/2蛋白磷酸化的影响。并观察GPER阻断剂G-15(5μM),SphK阻断剂DMS(10μM),ERK1/2阻断剂PD98059(20μM)预处理细胞后,对E2引起的ERK1/2磷酸化变化的影响。分组如下:(1)空白对照组;(2)E2处理组;(3)G-15+E2组;(4)DMS+E2组;(5)PD98059+E2组。4.Cyclin D1、Cyclin E1、MMP-9的蛋白表达采用Western blot方法检测E2和GPER阻断剂G-15、SphK阻断剂DMS、ERK1/2阻断剂PD98059作用于细胞24小时之后,下游信号分子Cyclin D1、Cyclin E1、MMP-9的蛋白表达情况。分组如下:(1)空白对照组;(2)E2处理组;(3)G-15+E2组;(4)DMS+E2组(5)PD98059+E2组。5.细胞增殖、迁移和侵袭采用MTT实验检测E2、GPER阻断剂G-15、SphK阻断剂DMS、ERK1/2阻断剂PD98059作用于细胞24小时之后,对细胞增殖的影响。分别采用划痕实验和transwell实验检测E2、G-15、DMS、PD98059作用于细胞48小时之后,对细胞迁移和侵袭的影响。结果:一、雌二醇对HEC-1A细胞增殖、迁移和侵袭的影响1.E2对HEC-1A细胞增殖的作用与Ctrl组相比,E2处理组HEC-1A细胞的增殖能力显著增加,同时我们选择了1×10~-77 M浓度的E2进行后续实验。2.E2对HEC-1A细胞迁移的作用与Ctrl组相比,E2处理组HEC-1A细胞的迁移能力显著增加。3.E2对HEC-1A细胞侵袭的作用与Ctrl组相比,E2处理组HEC-1A细胞的侵袭能力显著增加。二、GPER/SphK介导雌二醇的非转录效应激活ERK1/2通路1.HEC-1A细胞中SphK1/2的表达情况HEC-1A细胞中SphK1和SphK2均有表达,而且E2处理之后,各组蛋白表达没有明显变化。2.SphK的活性变化E2能够刺激细胞引起快速短时的SphK活性增加,并且最大值出现在15分钟。然后使用GPER阻断剂G-15后,与Ctrl组相比,E2处理组SphK活性显著增加,G-15组SphK活性显著降低;与E2处理组相比,G-15+E2组SphK活性显著降低,表明E2对SphK的激活作用可被G-15所阻断,E2是通过GPER的非转录途径快速激活SphK的。3.ERK1/2的磷酸化变化p-ERK1/2的蛋白表达在5 min和15 min的时候显著增加,其中5 min的时候蛋白表达最高,表明E2可以在短时间内快速激活ERK1/2信号通路。使用GPER、SphK、ERK1/2阻断剂G-15、DMS、PD98059后,与Ctrl组相比,E2处理组p-ERK的蛋白表达显著增加,与E2处理组相比,各阻断剂与E2共同处理组p-ERK的蛋白表达显著降低,表明E2对ERK1/2信号通路的激活作用可被G-15、DMS和PD98059所阻断,E2是通过GPER/SphK通路快速激活ERK1/2信号分子的。4.Cyclin D1、Cyclin E1、MMP-9的蛋白表达与Ctrl组相比,E2处理组Cyclin D1、Cyclin E1、MMP-9蛋白表达显著增加,与E2处理组相比,各阻断剂与E2共同处理组三种蛋白的表达显著降低。5.细胞增殖、迁移和侵袭与Ctrl组相比,E2处理组细胞增殖、迁移和侵袭能力显著增加,而各阻断剂能够显著降低E2促进细胞增殖、迁移和侵袭的作用。结论:E2能够促进HEC-1A子宫内膜癌细胞增殖、迁移和侵袭。GPER/SphK通路参与了雌二醇介导的HEC-1A子宫内膜癌细胞增殖、迁移和侵袭,该作用与激活ERK1/2信号通路,诱导Cyclin D1、Cyclin E1、MMP-9蛋白表达有关。