原发性肝癌(PLC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,早发现、早治疗,对延长病人生存期具有非常重要的意义。AFP是目前临床上应用最广的肝癌诊断标志物,但其在肝癌诊断中存在一定的漏诊率和误诊率;而目前应用的其它指标还无法替代AFP作为肝癌标志物的价值。鉴于此,寻找新的诊断标志物一直是人们探求的目标。1996年Pilia等人从过度生长综合症中发现了聚糖蛋白家族的新成员——GPC3基因,以后的研究发现:GPC3 mRNA是一个在肝癌细胞内高表达的基因,它在肝癌病例癌组织,尤其是小肝癌患者以及AFP阴性的肝癌患者中检出率很高,使我们看到了它作为肝癌潜在的新的肿瘤标志物的广阔应用前景。本项目即以GPC3蛋白为重点研究对象,同时从肝癌组织及血清两方面研究入手,目的是探讨GPC3蛋白作为肝癌组织学及血清学标志物的可能性,并对其临床应用价值进行评价。 本研究的第一部分:抗GPC3多克隆抗体的制备、纯化、鉴定及初步应用。在本实验室对GPC3已经取得的研究基础上,利用原核表达系统,诱导表达了GPC3蛋白C端523个氨基酸,改进并简化了原有繁琐的纯化方法,得到了预想纯度及浓度的抗原,在此基础上制各了兔抗人GPC3蛋白多克隆抗体,经间接ELISA方法鉴定,免疫后的血清效价很高,再利用商品化的蛋白G微球纯化法纯化了该多克隆抗体,通过SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝染色的结果提示纯化效果佳。随后我们对该纯化的抗体进行了Western Blot实验鉴定,对相同的肝细胞型(HCC)肝癌组织及其癌旁组织同时用免疫前、后获得的兔多抗进行杂交,我们发现:与免疫前兔多抗杂交结果显著不同的是,免疫后的多抗杂交出一条分子量约70kDa的蛋白条带,这与GPC3的核心蛋白带分子量大小相一致,此外也发现在肝癌细胞系HepG2、HuH-7、Hep3B中也有相同的杂交带,在非肝癌细胞系Hela细胞则无此条带;通过Western Blot实验,我们对多例血管瘤旁正常肝组织及HCC、胆管细胞型(ICC)肝癌及配对癌旁肝组织进行了研究,发现正常肝组织不表达GPC3蛋白。26例HCC中癌组织及癌旁组织表达GPC3蛋白的比例分别为84.6%(22/26)、30.8%(8/26),在表达强度上,多为癌组织强于其配对癌旁肝组织;7例ICC中,仅有2例可见GPC3蛋白表达。 本研究的第二部分:GPC3在肝癌临床病理中的应用研究。应用第一部分