研究背景乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一,其发病对生活质量造成严重影响。在全球范围内,乳腺癌占了女性侵袭性肿瘤的22.9%和全部肿瘤的16%。乳腺癌在发达国家中的发病率比发展中国家的发病率要高,这与发达国家的饮食等生活习惯有关。近年来,随着我国人们生活水平的逐步提高,乳腺癌呈现出了多发高发的态势,据统计,乳腺癌的发病率占全身恶性肿瘤的7-10%。乳腺癌因其高转移性、高侵袭性对人们的健康影响更大。乳腺癌的转移是一个复杂的多步骤生物学过程,它包含着癌细胞扩散到身体的其他器官或组织,乳腺癌细胞发生转移时,其产生的后果对病人往往是致命的。而乳腺癌的转移也有着其喜好性,一般会发生骨转移、肺转移、区域淋巴结转移、肝转移、肾转移、脑转移等,其中最常见的是骨转移。乳腺癌已经严重影响到广大人民的生活水平、生活质量。因此研究乳腺癌的转移具有重要的现实意义。肿瘤的转移是肿瘤细胞从一个器官或组织向另外一个不直接相连的器官或组织扩散,恶性肿瘤细胞或感染性疾病具有转移能力。肿瘤从一个单一的肿瘤细胞开始,大部分肿瘤细胞可以浸润淋巴壁和血管壁,然后肿瘤细胞通过血流环绕全身。当肿瘤细胞到达另一个组织或器官后,肿瘤细胞重新浸润血管壁或淋巴壁,继续增殖并最终形成继发肿瘤。转移和侵袭是肿瘤的重要生物学特征,也是肿瘤的主要致死因素。转移和侵袭是同一过程的不同阶段,侵袭贯穿于转移的全过程,同时也是转移的前奏,转移是侵袭的最终结果。侵袭和转移是恶性肿瘤发生发展过程中密不可分的相关阶段。乳腺癌细胞发生转移时与周围的组织相互作用,然后胞外基质(Extracellular matrixc, ECM)作为屏障阻止癌细胞迁移,因此迁移必须要突破ECM。乳腺癌的迁移同时也依赖于肿瘤的血管生成,新生的血管是具有侵袭能力的肿瘤细胞迁移并扩散的一个重要条件,可为乳腺癌细胞提供营养和迁移通道。遗传因素中,抑癌基因和致癌基因在其中起到重要作用,当一些抑癌基因缺失或致癌基因增高时,可能导致癌症。目前研究的一些与乳腺癌有关的基因主要包括：BRCA、MsH2、MsH6、p53、ERK、JNK、TRPs通道等。TRPs (transient receptor channels)通道是一类位于细胞膜上的重要阳离子通道,其亚型较多,分属7个亚家族,机制各异,涉及到疼痛、温控、机械感觉、味觉等,功能非常复杂。TRPM7是由Loren W于2001年发现并报道的,刚开始TRPM被命名为：TRP-PLIK,其蛋白分子量大小在220KDa,后经研究发现,TRPM7分子是具有6个跨膜通道跨膜蛋白。现已证实,TRPM7的第5和第6跨膜之间主要通透钙离子和镁离子等二价阳离子,对细胞的生物学行为起调节作用,而镁离子对于TRPM7是相对特异的。最近的研究表明,TRPM7分子对癌细胞的增殖、粘附起到重要作用,并与癌细胞的迁移、侵袭有关。而发生这些细胞的生理生化活动必然涉及到细胞的信号转导。本研究初步探讨TRPM7分子对乳腺癌细胞MDA-MB-435s的迁移和侵袭的改变,并分析TRPM7分子在乳腺癌细胞的迁移、侵袭中对下游MAPK通路磷酸化的影响,为阐明TRPM7分子对乳腺癌细胞迁移和侵袭的作用机制研究提供新的理论基础。Src是一种原癌基因酪氨酸激酶,原癌基因在胚胎发育和细胞的增殖中起到重要作用,该基因编码的蛋白是一种酪氨酸蛋白激酶,这种酪氨酸蛋白激酶的活性可以被Src激酶的磷酸化所抑制。Rui Zheng等人在肺癌细胞中发现,通过加入Src-酪氨酸激酶抑制剂可以明显地抑制A549肺癌细胞的增殖和侵袭,说明Src的酪氨酸激酶在肺癌的增殖和侵袭中起到重要作用。Hiscox等人证明了在三苯氧胺耐药的乳腺癌细胞中,增加Src的活性可以促进乳腺癌细胞的侵袭和迁移。另外,有研究表明,转染进Src的NIH 3T3成纤维细胞中的的粘着斑C-末端结构域可以抑制细胞的侵袭和转移。这些都说明Src在细胞的转移和侵袭中扮演着重要角色。MAPK是苏氨酸/丝氨酸特异性蛋白激酶,发现其与分裂素、渗透压、热休克、促炎细胞因子等胞外刺激高度相关；同时MAPK也调控着各种细胞功能,例如分化、增殖、凋亡、基因表达等。Krueger认为雌激素受体阴性和侵袭性的乳腺癌细胞中的MAPK受到上调,雌激素阳性细胞系和非侵袭性的乳腺癌细胞中的MAPK却没有变化。Demuth T等证明在神经胶质瘤中,发现MKK3和p38促使神经胶质瘤侵袭,并通过检测MKK3和p38的丰度来预测病人的预后。SaikaS等利用在愈合期的老鼠角膜上皮中发现,p38MAPK的磷酸化和核转位非常明显。这些证据都说明MAPK家族与肿瘤细胞的迁移、侵袭和增值强烈相关。目的本实验采用siRNA干扰技术对乳腺癌细胞MDA-MB-435s的TRPM7分子进行下调,观察乳腺癌细胞迁移和侵袭的改变,分析其对Src和MAPK通路蛋白的影响,初步阐明TRPM7分子在乳腺癌细胞迁移、侵袭过程的作用。方法1.常规培养乳腺癌细胞MDA-MB-435s,生长对数期对细胞进行传代。2.酸性酚-硫氰酸胍-氯仿提取法纯化乳腺癌细胞MDA-MB-435s中的总RNA,然后进行荧光定量PCR检测siRNA对TRPM7的干扰效率。3.脂质体瞬时转染方法将TRPM7-siRNA片段转染进乳腺癌细胞后,光学显微镜下观察癌细胞干扰前后的细胞形态变化、粘附力变化情况。4.划痕实验和Transwell小室实验检测乳腺癌细胞的迁移能力的变化。5. Transwell小室铺胶实验检测乳腺癌细胞的侵袭能力的变化。6. Western Blot检测乳腺癌细胞中的TRPM7、Src、AKT、ERK、p38、JNK磷酸化蛋白丰度的变化。结果1.脂质体转染法可以有效的对乳腺癌细胞MDA-MB-435s进行RNA转染,转染效率达到93.24%,正常组与转染组的细胞个数没有显著性差异(n=4,P>0.05)。2. qRT-PCR结果显示转染体系可以有效的对乳腺癌细胞MDA-MB-435s进行干扰,平均干扰效率达到76.70%,两个干扰组的TRPM7 RNA含量明显少于阴性对照组,具有显著性差异(n=3,P<0.05)；Western Blot结果同样表明可有效的对乳腺癌细胞MDA-MB-435s进行TRPM7干扰,平均干扰效率为69.13%,其中两个干扰组与阴性对照组相比,TRPM7蛋白含量明显降低,有显著性差异(n=3,P<0.05)；而两个干扰组之间没有显著性差异(n=3,P>0.05)。3. TRPM7干扰后,乳腺癌细胞粘附力出现明显下降,siRNA2组的细胞相对粘附力为46.50%,与其他两组相比具有显著性差异(n=3,P<0.05)；而其他两组之间相比,没有显著性差异(n=3,P>0.05)。4. TRPM7-siRNA干扰后,乳腺癌细胞迁移能力出现明显下降(n=3,P<0.05)；其中siRNAl和组与NC组之间没有显著性差异(n=3,P>0.05)；siRNA2组的迁移能力与其他两组相比,具有显著性差异(n=3,P<0.05)。5. TRPM7-siRNA干扰后,乳腺癌细胞侵袭能力出现明显下降(n=3,P<0.05)；其中siRNAl和siRNA2组与NC组之间相比均有显著性差异(n=3,P<0.05)；两个干扰组之间相比,没有显著性差异(n=3,P>0.05)。6. TRPM7-siRNA干扰后,乳腺癌细胞中的AKT及p-AKT表达量均未出现显著性变化(n=3,P>0.05)。7. TRPM7-siRNA干扰后,乳腺癌细胞中的Src表达量未出现变化,p-Src表达量出现下降。其中siRNA1组p-Src的相对百分比为71.58%；siRNA2组的p-Src的相对百分比为53.82%,两组之间没有显著性差异(n=3,P>0.05),但两组与NC组相比具有显著性差异(n=3,P<0.05)。8. TRPM7-siRNA干扰后,乳腺癌细胞中的p-38表达量未出现变化,p-p38表达量出现下降。其中,两个干扰组与NC组相比具有显著性差异(n=3,P<0.05)；而两个干扰组之间没有明显差别(n=3,P>0.05)；ERK表达量未出现变化,p-ERK表达量出现下降,具有显著性差异(n=3,P<0.05),两个干扰组之间没有显著性差异(n=3,P>0.05)；JNK表达量未出现变化,p-JNK表达量出现下降。其中,siRNA1组与NC组相比没有显著性差异(n=3,P>0.05);而siRNA2组与其他两个组相比有明显差别(n=3,P<0.05)。结论1.下调TRPM7蛋白可使乳腺癌细胞MDA-MB-435s的粘附力出现下降、迁移能力和侵袭能力减弱。2.下调TRPM7蛋白可使Src分子的活性和MAPK通路蛋白磷酸化降低,提示TRPM7对细胞的迁移和侵袭的调控可能是通过对改变MAPK通路上下游蛋白的磷酸化来进行。