论文部分内容阅读
北美海蓬子(SalicorniaBigeloviiTorr.)属于藜科(Chenopodiaceae)、海蓬子属(Salicornia)，是一种耐盐性极强的真盐生植物。其抗盐能力超过海水盐度的20％～40％，耐盐极限达到5％NaCl浓度，嫩茎中的可溶性盐分含量高达37％(干重百分比)。
植物Na+/H+逆向运输蛋白是一个跨膜运输蛋白，在植物耐盐性方面起着极为重要的作用。它负责将细胞质中的Na+排出胞外或者将细胞内的Na+运输到液泡内进行区隔化，从而降低了细胞质中的Na+浓度，使胞质中各种酶免受高Na+的毒害。对于北美海蓬子Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆以及进行结构与功能的分析，有利于在分子水平上详细了解该基因。将该基因转入到模式植物中，可以深入研究植物的耐盐机理以及该基因在植物耐盐中的重要作用。
本研究根据同源序列设计引物，通过RT-PCR方法从北美海蓬子中克隆出2591bp(GenBank登陆号为DQ157454)的Na+/H+逆向运输蛋白基因(NP)cDNA序列，该序列包括一段1683bp的开放读码框(openreadingframe，ORF)，编码一条含560个氨基酸的多肽，推测分子量为62.1KD。系统发生(Phylogeny)分析表明该蛋白序列与质膜上Na+/H+运输蛋白亲缘关系较远，与细胞器上的Na+/H+逆向运输蛋白亲缘关系更近，说明北美海蓬子Na+/H+运输蛋白NP应当是在植物液泡膜上，负责将细胞质中Na+运输到液泡中，起离子区域化的作用，从而提高植物耐盐性。
将该基因编码区序列构建到植物表达载体pVKH-35S-pA上，通过农杆菌介导将基因转入到模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)中。经过潮霉素抗性筛选和分离比筛选得到了转基因第三代(T3代)纯合子转基因植株。在200mmol/LNaCl胁迫下进行耐盐性分析表明，与野生型拟南芥相比，转基因植株耐盐能力得到了增强。说明了转入北美海蓬子Na+/H+逆向运输蛋白基因可以提高拟南芥的耐盐能力。
耐盐性是一个复杂性状，往往是由多个基因协同控制的。要想在整体水平上深入研究植物耐盐性，必须全面研究所有耐盐相关基因。为了分离北美海蓬子在盐胁迫下的一系列特异表达基因，进而鉴定这些基因在北美海蓬子耐盐过程中的作用，从而进一步弄清北美海蓬子耐盐机理。本研究利用SSH技术构建了北美海蓬子盐胁迫相关基因差减cDNA文库，分离到一批盐胁迫条件下特异表达的基因片段。
以播种于含0mmol/L的NaCl的液体MS基本培养基上的北美海蓬子幼苗总RNA(0号)和200mmol/LNaCl的液体MS基本培养基诱导24小时后的幼苗总RNA(2号)为模板，运用SMARTPCRcDNA合成技术分别合成全长cDNA。将两种cDNA群体进行抑制差减杂交，用T/A法分别构建正向差减文库(含205个克隆)和反向差减文库(含235个克隆)。采用PCR方法筛选正向差减文库获得138个重组子克隆，通过反向Northern斑点杂交筛选，得到在盐胁迫下特异表达的阳性差异片段克隆85个。对这些重组子的cDNA插入片段进行了序列测定，测序结果正常的克隆共81个，可以进行BLASTn分析。其中，有70个cDNA序列与已经报道的其它物种的核酸序列具有较高的同源性，可以推测其功能；另外11个cDNA序列未找到有较高相似性的已知序列，是未知基因。81个cDNA序列中没有与北美海蓬子中已报道的核酸序列有较高的相似性，因此，所有81个克隆序列都是新基因。