低温是限制植物分布、生长发育和产量的重要因素。低温胁迫条件下,很多生物过程,如光合作用、蛋白质合成、膜脂代谢和次生代谢都会受到影响。生物膜是低温伤害的初始位点,低温时植物首先发生膜脂的物相变化,从液晶相转为凝胶相,植物对低温的抗性与膜脂的不饱和脂肪酸含量密切相关。玉米是全世界范围内种植面积最大的作物种类之一,也是我国重要的粮食作物、饲料作物和工业原料。玉米属于亚热带或热带作物,其最适生长温度在25-28℃之间,全生育期所需的积温大于10℃,当温度低于12℃时,玉米植株就很容易受到低温胁迫。在早春播种时,玉米经常遭受低温胁迫,影响种子萌发和幼苗生长,甚至会造成大面积的缺苗,导致播种时期延误,最终导致减产。因此,深入研究玉米耐低温的生理和分子机制具有重要的科学意义和实践价值。本研究利用玉米自交系为实验材料,从生理生化、转录组和分子生物学等方面探究其耐低温的机理,并筛选参与其耐低温的关键基因,为利用生物技术培育耐低温玉米新品系奠定基础。主要结果如下:(1)抗低温和不抗低温玉米自交系的筛选以102个玉米自交系为材料,4℃低温处理两周后,通过观察表型,先初步筛选出其中较抗低温的M54、W54、287M、24034和不抗低温的753F、24045、KWS9384M、B73。对筛选出的8个自交系继续进行幼苗期耐低温能力分析,测定了低温胁迫下8个玉米自交系地上部分的干鲜重,地下部分的干鲜重,株高和叶面积,利用隶属函数值对该8个自交系进行抗低温能力排序,最终我们确定了抗低温自交系M54和不抗低温自交系753F进行后续的实验。(2)M54和753F的抗低温能力分析将M54和753F在4℃低温下处理0h、4h、8h、12h和24h,测定低温处理条件下的叶绿素荧光参数Fo和Fv/Fm,活性氧含量和抗氧化酶活性,类黄酮和总酚含量以及膜脂和脂肪酸含量,结果表明,在低温处理条件下,抗低温自交系M54的PSⅡ光抑制程度较轻,抗氧化酶活性较强,次生代谢物质在体内的积累也比753F高,饱和脂肪酸含量降低,不饱和脂肪酸含量升高,抗低温能力较强。(3)利用高通量转录组测序分析玉米自交系抗低温的分子机理对4℃低温处理0h、4h、24h后M54和753F的叶片提取RNA并进行了高通量转录组测序。在低温处理4h时,M54和753F中各有1665和547个基因呈现差异表达,在低温处理24h时,M54和753F中各有3970和1766个基因呈现差异表达。将差异表达基因与NR,Swiss-Prot,GO,COG,KOG,Pfam,KEGG数据库进行序列比对,获得差异基因的注释信息。通过KEGG注释,我们发现与抗低温相关的多个通路在两个自交系中均呈现差异表达基因富集现象,如苯丙烷途径、苯丙氨酸代谢途径、淀粉和糖代谢途径、碳代谢途径等,这表明在玉米抗低温过程中,次生物质代谢及碳水化物代谢起到重要作用。转录组结果显示,与光合过程碳固定相关的差异表达基因在两个自交系中都上调表达。在M54中,低温处理4h和24h后,分别有4个和8个差异基因上调表达。在753F中,只有在低温处理24h后,有一个编码5-磷酸核酮糖异构酶的基因差异表达。在膜脂代谢途径中,低温处理4h后,M54中有4个与脂肪酸去饱和相关的差异基因上调表达。而在753F中,只有1个编码ω-3脂肪酸去饱和酶的基因上调表达。在次生代谢过程中,苯并嗪类生物合成相关的差异表达基因只在M54自交系中存在。在类黄酮和苯丙素生物合成途径中,大部分差异基因都是上调表达,而且在M54中表达量更高。(4)次生代谢途径中与抗冷相关基因的筛选、亚细胞定位及功能分析我们根据转录组数据,对与次生代谢相关的转录因子进行了筛选,最终选定MYB-IF35和MYB31进行下一步的基因分离和功能验证,这两个基因在低温处理条件下只在M54中有差异表达。利用TMHMM、SMART、Ex PASy等在线软件对这两个基因的生物信息学特性进行了分析,预测了其蛋白结构及理化性质,为进一步研究其功能奠定基础。我们设计特异引物,从玉米cDNA中扩增到MYB-IF35和MYB31的全长序列。亚细胞定位结果表明玉米MYB31和MYB-IF35定位于细胞核上。将这两个基因全长经双酶切后与表达载体连接,构建了pMWB110-MYB31和pMWB110-IF35过表达载体,并成功转化到农杆菌EH105中,由武汉中国种子集团有限公司进行玉米转化。同时构建了pROKⅡ-MYB31和pROKⅡ-IF35过表达载体,转化拟南芥,结果表明玉米MYB31和MYB-IF35的过量表达能够减轻低温对拟南芥光合反应中心的破坏,减轻低温光抑制;增强抗氧化酶(SOD和APX)的活性,有效清除活性氧,减轻活性氧对光系统的破坏,提高转基因拟南芥的抗低温能力。