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NAC(NAM/ATAF/CUC)转录因子是特异存在于植物中的新型转录因子,具有调控植物的生长发育和对环境胁迫响应等多种生物功能。但是,有关农作物NAC转录因子的研究尚少。AhNAC3(GenBank登录号EU755022)是本实验室在2009年从花生克隆的NAC基因,生物信息学分析表明AhNAC3蛋白N端保守,C端存在高度多变且频繁出现简单重复氨基酸的转录激活区。本论文应用正向遗传学的方法研究花生NAC转录因子AhNAC3基因在烟草中异源表达的效应,为研究其在花生抗旱性中的作用提供依据,主要获得了以下结果:
1.AhNAC3-GFP融合蛋白定位于烟草叶片原生质体细胞核,通过生物信息学预测其核定位区域位于蛋白N端(1～190aa)内；结合前期酵母实验结果,AhNAC3蛋白存在转录活性,进一步证明AhNAC3属于NAC转录因子。
2.确定了AhNAC3基因高效转化中烟90的体系为:OD6000.8菌液离心沉淀,悬浮于50ml激活液,侵染预培养1-2d的外植体8-10min,共培养2d,经无菌水冲洗,于羧苄青霉素和头抱霉素浓度分别为300 mg/L和500 mg/L的脱菌液中振荡40 min,超净工作台上吹风30 min,转移至筛选分化培养基中50 d,最高可获得92.34％抗性苗,对抗性植株进行PCR和RT-PCR检测,最高可获得78.19％拟转基因烟草。
3.在正常条件下,拟转基因烟草生长快于野生型植株,2月龄T1代拟转基因烟草在株高、叶长、叶宽和叶数等农艺性状表现出生长优势。与野生植株对比,在正常条件下T0代拟转基因植株保水性最高增强了42.16％；经30％PEG处理3d,7月龄T0代拟转基因烟草叶片的失水率降低4.33％,2月龄T1代拟转基因烟草叶片失水率降低16.30％；经300mM甘露醇处理3d,T0代AhNAC3-GFP及AhNAC3拟转基因型叶片的叶绿素含量分别提高167.88％和.36.83％；900mMNaCl高盐处理3d,T1代烟草叶片颜色及叶绿素含量均无明显变化。与GFP空白对照相比,在50mM NaCl低盐胁迫下,T1代AhNAC3-GFP拟转基因烟草种子的萌发率提高23.68％;在含15μM ABA的MS培养基上,T1代AhNAC3-GFP拟转基因烟草根长增加17.58％,根数增多245.45％,鲜重增加65.38％,叶绿素含量增加8.02％,表现为ABA不敏感性。
本研究结果表明AhNAC3具有转录因子活性,涉及拟转基因烟草生长发育和胁迫抗性的调控,使拟转基因植株生长加快,保水性增强、失水率降低,抗胁迫增强,种子萌发时期对盐胁迫抗性高,幼苗生长对ABA不敏感,为AhNAC3的功能研究提供依据。