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黏蛋白型O-聚糖是由多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族（ppGalNAc-Ts）催化起始的，通过将N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）连接到蛋白质的丝氨酸或者苏氨酸残基的羟基上，形成Tn抗原，然后进一步在多种糖基转移酶的催化下，形成复杂的O-聚糖结构。近年来的研究发现，肿瘤细胞中常伴随着黏蛋白型O-聚糖结构和数量上的改变，形成肿瘤特异聚糖结构，如Tn和T抗原。本实验室的前期结果发现人FoxA1可能是通过ppGalNAc-T4催化使其O-GalNAc糖基化，进而影响ERα阳性人乳腺癌细胞的生物学行为，但缺乏直接的实验证据。因此，确定FoxA1的O-GalNAc糖基化以及解析糖基化位点，对于了解FoxA1在乳腺癌发生发展中的作用机制有重要意义。 已知ppGalNAc-T4以O-GalNAc糖基化的糖蛋白为底物，本实验利用对未经糖基化修饰的底物有初级酶活的ppGalNAc-T2，体外催化FoxA1蛋白糖基化，验证FoxA1是否是O-GalNAc糖基化蛋白并解析糖基化位点，为进一步的研究提供依据。 本实验，首先根据人FoxA1蛋白的结构域，利用PCR技术，将人FoxA1的cDNA截断成覆盖全长的FoxA1-a，b和c三个片段，并分别将其构建到表达载体pET28a(+)上；载体构建成功后，分别转化到BL21(DE3)菌株进行表达，通过优化诱导条件，在27℃，4 h，IPTG浓度为0.1 mM时，重组蛋白实现较好的可溶性表达，并利用Ni琼脂糖亲和层析得到重组蛋白FoxA1-a，b和c。接下来，通过脂质体转染技术将人ppGalNAc-T2表达载体pFLAG-CMV-3-T2转染293T细胞，收集上清，利用Anti-FLAG凝胶亲和纯化得到重组蛋白 ppGalNAc-T2；以带有 FAM荧光标记的 EA2肽做受体底物，UDP-GalNAc做糖基供体进行体外酶活性反应，高效液相色谱结果显示ppGalNAc-T2有较好的酶活性。进一步，通过ppGalNAc-T2分别体外催化FoxA1-a，b和c，利用Lectin Blot、质谱（ESI-MS）检测反应前后FoxA1的糖基化变化，结果显示FoxA1-c蛋白是ppGalNAc-T2的体外底物，并且含有三个潜在的O-GalNAc糖基化位点。最后，依据糖基化位点分析软件，预测并合成一系列含/和不含FoxA1-c蛋白糖基化位点的短肽；体外ppGalNAc-T2酶促反应后，同上质谱分析，结果确定FoxA1蛋白的Ser354、Ser355位点丝氨酸残基发生了O-GalNAc糖基化。 以上实验结果表明：在体外，人FoxA1蛋白是ppGalNAc-T2的底物，并且发现了三个O-GalNAc糖基化位点，其中Ser354、Ser355位点丝氨酸被糖基化修饰，x317-350氨基酸序列内有一个糖基化位点。