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疣粒野生稻(Oryza granulata),是稻属Padia组植物,是稻属中起源最早的类群,向适应于早生方向发展,属GG基因组,二倍体2n=24,基因组大小为1201Mb,疣粒野生稻是国家二级保护植物,中国只在云南、海南两省有分布,而云南的居群类型是最多的。疣粒野生稻高抗白叶枯病。现已发现33个抗白叶枯病基因中5个是从野生稻种资源中鉴定的,而疣粒野生稻是研究白叶枯病抗性机理,发掘抗白叶枯病有关基因很好的植物资源。但是迄今关于疣粒野生稻高抗白叶枯病的基因研究很少,不利于揭示抗病机制和发掘利用高抗白叶枯病基因。栽培稻属于AA基因组,与疣粒野生稻很难进行自然杂交,难于获得近等基因系,从而限制了以图位克隆法获取疣粒野生稻抗白叶枯病有关基因。
基因芯片技术已被广泛应用于基因差异表达检测,也被逐渐用成植物抗病机理研究手段。基因芯片技术不断完善,已有水稻、拟南芥、番茄等模式植物的基因芯片出售,未见疣粒野生稻芯片出售,也没有疣粒野生稻芯片相关文献报道。本研究对疣粒野生稻不同18个代表居群材料抗病能力进行了鉴定;比较研究了疣粒野生稻叶片关键组织结构是否影响疣粒野生稻的抗白叶枯病能力;首次研制了疣粒野生稻叶片应答黄单胞杆菌水稻致病变种(Xoo)的基因芯片,该芯片含有2436个基因片段,来自于疣粒野生稻叶片应答Xoo的均一化全长cDNA文库和差减文库。探索了基因芯片制备过程中的方法要点,建立起规范的芯片制备体系。研究发现:不同疣粒野生稻材料抗病能力有一定差异,但是多数材料表现高抗,甚至免疫白叶枯病,只有两个居群对其中一种生理小种感病。高抗白叶枯病的疣粒野生稻与重感白叶枯病栽培稻米泉黑芒的叶片解剖结构特征,如叶表皮毛、导管大小和数量、叶肉细胞、叶片表皮细胞等,特别是的维管束(白叶枯病发生发展的植物关键组织部位)不存在明显差异,预示着疣粒野生稻对白叶枯病具有寄主抗性,即抗性由基因决定。以接种Xoo(C1、Y8)1d、2d、3d的景洪疣粒野生稻叶片为处理,以接蒸馏水的景洪疣粒野生稻叶片为对照,与制备好的芯片杂交,明显上调表达的片段有383个,明显下调表达的片段有836个,比值在0.5-1.5之间的片段有1063个。随机选取近800个点的克隆进行测序,测序结果在NCBI基因库上进行比对,有35个片段无同源序列,大部分未知功能,选取10个序列提交GenBank,注册序列号分别为:EF119781-EF119790。芯片测序结果中有1个NBS-LRR型基因,外施水杨酸并不诱导其表达;5个泛素类蛋白基因,其中一个RACE扩增出全长有1496bp,是泛素结合蛋白E2基因;4个热激蛋白基因,3个金属硫蛋白基因,RACE扩增出其中一个全长有969bp;有6个丝氨酸/苏氨酸激酶类蛋白基因;有多个脂类相关蛋白基因,其中有4个是脂质转运蛋白基因;此外还有抗坏血酸过氧化物酶基因、谷胱甘肽硫转移酶基因、谷胱甘肽过氧化物酶基因、伸展蛋白基因等。在理论上初步揭示了疣粒野生稻应答Xoo的基因表达特点,识别了一批具有潜在抗病功能的基因。
本研究从解剖学、分子生物学的角度初步揭示认识疣粒野生稻高抗白叶枯病机制,发现疣粒野生稻高抗白叶枯病,不是非寄主抗性,而是植株受病原菌诱导获得系统性抗性。为进一步揭示疣粒野生稻高抗甚至免疫白叶枯病的机制,发现、筛选和分离利用高抗白叶枯病基因奠定了基础。