论文部分内容阅读
黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)是雀麦花叶病毒(Bromoviridae)黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)的代表性成员，是世界范围内分布最为广泛的一种植物病毒，能够侵染包括单双子叶植物的100科500多属1200多种植物，危害许多重要的农作物和经济作物。黄瓜花叶病毒编码的2b蛋白是最早被鉴定出的RNA沉默抑制子之一，能够抑制植物RNA沉默系统对病毒RNA的降解，有利于病毒的系统扩散。翻译后修饰在植物抵御病原侵染的过程中有重要作用，植物病毒的运动蛋白多见磷酸化修饰。CMV2b蛋白序列中含有很多潜在的翻译后修饰位点，但目前还没有关于2b蛋白发生翻译后修饰的报道。
为了研究潜在翻译后修饰对2b功能的影响，我们分析了CMV Q株系的2b蛋白(Q2b)的序列，选择位于其核定位信号-磷酸化位点保守区内部及附近的4个潜在翻译后修饰位点(K22，S28，K39，S40)，检测这些位点突变后2b的功能活性变化。Q2b的K39，S40位点对其功能很重要，当K22和K39双突变为R或者S40突变为A后，Q2b抑制系统沉默的活性基本丧失。K22和K39双突变为R后，Q2b抑制局部沉默的活性增强；S40突变为A后，Q2b抑制局部沉默的活性减弱。K22和K39双突变为R或者S40突变为A后，Q2b蛋白的稳定性下降。K22突变为R后，Q2b抑制子活性无明显变化，致病性略有增强；S28位点突变为A后，Q2b抑制子活性增强，但可诱发超敏反应，使致病性减弱。我们试图对2b蛋白潜在的翻译后修饰进行直接验证，但尚未能完全确定以下结论：(1)2b可被磷酸化，S40是一个CKⅡ识别的磷酸化位点；(2)2b可被泛素化，K39是一个发生K48-链泛素化修饰的位点；(3)2b不发生SUMO化。
为了提高Q2b蛋白稳定性，我们将SD2b的功能关键结构域引入Q2b中。利用重叠PCR方法将SD2b序列中63至71位氨基酸组成的Domain3基序插入Q2b序列中相应位置，分析获得SD2b Domam3后Q2b的蛋白稳定性及抑制子活性变化。SD2b Domam3可以增强Q2b蛋白稳定性，但能使Q2b抑制局部沉默的活性减弱。减弱的抑制子活性不是由Q2b亚细胞定位改变造成的。SD2b Domain3不是出核信号，不改变Q2b的核定位。