论文部分内容阅读
目的：探索131I标记靶向成纤维生长因子8（FGF8）小分子多肽HSQAAVP（组氨酸-丝氨酸-谷氨酰胺-丙氨酸-缬氨酸-脯氨酸）的最佳条件，并获得放射化学纯度大于95％的标记产物131I–HSQAAVP。研究131I–HSQAAVP体外稳定性及生物学活性；研究鉴定标记产物131I-HSQAAVP在体外对前列腺癌LNCaP、DU145细胞杀伤作用。 方法：采用氯胺-T法对多肽HSQAAVP进行131I标记，通过正交实验筛选最优标记条件。选Sephadex G25凝胶层析柱对标记混合液分离纯化得到标记产物131I-HSQAAVP，用薄层层析技术（TLC）测定其标记率及放射化学纯度。将分离纯化的新型分子探针131I-HSQAAVP（放射化学纯度大于95％）分别放置于室温及加入人血清后，在37℃条件下，放置24小时，分别测定不同时间段其放射化学纯度，观察其稳定性。体外培养前列腺癌LNCaP细胞及DU145细胞，用CCK-8法对人前列腺癌细胞系LNCaP、DU145进行增殖抑制实验，分别计算HSQAAVP以及131I-HSQAAVP对LNCaP、DU145细胞的抑制率，判断131I-HSQAAVP的生物学活性。在培养好的前列腺癌LNCaP细胞、DU145细胞株中，分别加入不同放射性活度的131I-HSQAAVP、131I、以及与标记肽相同浓度的HSQAAVP，并设置空白对照组，干预48h后，应用光学显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞分析来鉴定131I-HSQAAVP对前列腺癌LNCaP细胞及DU145细胞株的杀伤作用。 结果：最佳标记条件中，室温条件下(25℃)，在反应体系50μL0.5mol/L pH7.4的PBS缓冲液中投入HSQAAVP50μg与131I74.0Mbq（2mCi），再加入10μL(1mg/mL)的氯胺-T,振荡反应5min,用20μL(2 mg/mL)偏重亚硫酸钠溶液终止反应，得到标记率(71.5±3.03)%的标记混合液。经柱分离纯化后，放化纯可达到95%以上。体外稳定性实验结果表明，131I-HSQAAVP分别在25℃和加入人血清后，37℃条件下放置24h后，测得其放射化学纯度均大于90%。131I-HSQAAVP和HSQAAVP对前列腺癌细胞LNCaP、DU145增殖的抑制率差异无统计学意义（P>0.05），说明HSQAAVP在被131I标记后，原有肽的生物学活性并未发生改变。绿色荧光素FITC通过与小分子肽HSQAAVP连接，特异性的和前列腺癌细胞结合，被细胞摄取。激光共聚焦（Confocal）显微镜下FITC-HSQAAVP与LNCaP、DU145两种前列腺癌细胞在37℃孵育24 h后,在绿色荧光通道下均呈绿色强荧光显色。细胞摄取绿色荧光的能力反应小分子多肽HSQAAVP和两种细胞的亲和力，两者呈正相关。说明对雄激素激素敏感的LNCaP细胞和不敏感的DU145细胞均与HSQAAVP有较强的结合能力。在多肽HSQAAVP和131I-HSQAAVP对人前列腺实质肿瘤细胞系LNCaP、DU145增殖抑制实验中，通过公式计算其抑制率，证实多肽HSQAAVP及131I-HSQAAVP均对人前列腺实质肿瘤细胞LNCaP、Du145均有增殖抑制作用。抑制的效果因多肽或131I-HSQAAVP浓度的增加而增加。但两者间的抑制率无统计学意义（P＞0.05），即多肽HSQAAVP和131I-HSQAAVP对前两种前列腺癌细胞系LNCaP、DU145的增殖抑制效果无差异。 131I-HSQAAVP对LNCaP细胞及DU145细胞杀伤作用鉴定结果：倒置显微镜下可以看到到凋亡细胞存在。激光共聚焦荧光显微镜下，透过红色通道观察，凋亡细胞呈团状或碎块状致密红色强荧光。流式细胞分析结果显示131I-HSQAAVP与HSQAAVP都对LNCaP、DU145细胞具有诱导细胞凋亡作用，但131I-HSQAAVP对细胞的杀伤作用均明显高于HSQAAVP，且凋亡率与加入131I-HSQAAVP放射性活度呈正相关。 结论：通过氯胺T法将131I标记多肽HSQAAVP简单高效，新分子探针131I-HSQAAVP的生物活性仍被保留，且未受到明显破坏；细胞凋亡是导致细胞损伤的重要机制之一，通过131I-HSQAAVP对前列腺癌LNCaP细胞及DU145细胞的诱导，发现131I-HSQAAVP杀伤作用明显；131I-HSQAAVP新分子探针的成功制备和其对前列腺癌LNCaP、DU145细胞的杀伤作用影响为后期的动物实验提供理论基础。