猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea英文缩写PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus英文缩写PEDV)引起的一种猪接触性肠道传染疾病,该病的临床表现为腹泻,呕吐,脱水等,其临床特征类似于猪传染性肠胃炎。早在1971年于英国首次爆发。猪流行性腹泻以哺乳猪仔猪受到的危害最为严重,感染仔猪致死率可以达达到90%以上,潜伏期为5-8天,多发于冬季。PEDV为冠状病毒科冠状病毒属的RNA病毒,由PEDV引起的猪流行性腹泻在我国大部分地区对养猪行业造成了不可估量的损失。能找出一种快速准确的诊断方法诊断出该病对预防控制猪流行性腹泻起到重要的作用。单克隆抗体针对单一的抗体及位点高度专一,能够准确的诊断出疫病。稳定、高效的单克隆抗体为找到快速诊断猪流行性腹泻方法指引方向。能找出若干快捷准确的判定方法诊断出猪流行性腹泻病。单克隆抗体对预防、控制猪流行性腹泻起到重要的作用。单克隆抗体对PEDV的结构功能与基因变异都有重要的指导作用。因此本研究的目的是制取高效,稳定的单克隆抗体。试验制备单抗从以下几个方面入手:1.PEDV单克隆抗体抗原的增殖与纯化单克隆抗体可以在猪病毒性感染疾病的抗原结构功能分析,抗原变异性研究和诊断与控制中起重要作用。基于单抗研究产生的胶体金更可以快捷,简便,高效的对样品进行检测。对PEDV的增殖与纯化是能否能成功制备出PEDV的单克隆抗体的基础环节。Vero细胞为用于本试验扩增PEDV的细胞。接种病毒于Vero细胞后大约36h左右即可观察发现细胞病变,在Vero细胞病变到达90%时进行收集保存。反复冻融3次以上后,离心取上清液,将上清液高速离心后取沉淀,用PEG法对所收集的沉淀液进行浓缩粗提纯。浓缩后即为试验所用的免疫抗原。将纯化后的样品进行常规鉴定,利用RT-PCR和荧光定量PCR鉴定其是否具有免疫反应原性。2.PEDV单克隆抗体杂交瘤细胞株建立经方阵滴定法建立了PEDV的间接ELISA检测方法。结果显示:包被PEDV最适工作浓度为2.0μg/ml,最佳包被温度为4摄氏度。最佳时间为12小时。最适酶结合物稀释液为1%BSA-PBST,辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠Ig G(酶标二抗)最适稀释倍数为l∶4000,作用时间为30 min。将纯化过的PEDV接种于小鼠,每隔7日再进行免疫。用间接ELISA方法对小鼠血清进行效价测定。可以通过检测大于105的小鼠血清滴度来进行细胞融合。在融合前第三天,选择具有最高血清滴度的免疫小鼠并进行增强。三天后,将小鼠脾脏免疫,脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,观察状态。3.PEDV单克隆抗体腹水的制备将PEDV与PEDV-N蛋白作为筛选抗原,利用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆,再用两种ELISA法筛选,结果显示:选取出3株可稳定分泌抗PEDV病毒抗体的杂交瘤细胞株(3C10、5G8、5F4)。将阳性单克隆克隆培养在96孔板中并转移到24孔细胞板中并转移到6孔细胞板中,将阳性杂交瘤细胞转移到细胞瓶内以扩增培养物。扩大培养过程中,应及时冻存阳性杂交瘤细胞留做备用。通过腹水诱导法大量制备PEDV的单克隆抗体。对所得PEDV单克隆抗体进行生物学鉴定,成功获得1株可稳定分泌PEDV抗体的杂交瘤细胞株(3C10),单抗3C10的染色体数目与其他株相比远远超出许多;腹水的抗体效价为1:7.5×104,浓度为7.55 mg/ml。单抗3C10为Ig G2b亚类;能够与PEDV特异性结合,且仅与结构蛋白N反应;稳定性鉴定结果表明,3C10能稳定分泌抗体。本研究为进一步建立PEDV抗体阻断ELISA及胶体金免疫层析快速检测方法奠定了基础。