Mincle对真菌性角膜炎中性粒细胞凋亡的调控作用

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目的:研究巨噬细胞诱导c型凝集素(Macrophage inducible C-type lectin,Mincle)在真菌性角膜炎中对中性粒细胞凋亡的调控作用。方法:随机将健康的C57BL/6小鼠分为对照组和烟曲霉菌角膜炎组,分别于建模后12小时、1天、3天、5天裂隙灯显微镜下观察小鼠角膜感染情况,收集全角膜,检测Mincle的表达情况。用Mincle激动剂TDB以及Mincle中和抗体球结膜下注射预处理后,然后在烟曲霉菌感染小鼠角膜1天及3天,观察小鼠角膜感染情况,收集全角膜,q RT-PCR法检测小鼠角膜中Mincle、FAS、FASL和Caspase3 m RNA的表达,免疫荧光检测小鼠角膜中性粒细胞的浸润和细胞凋亡情况。从小鼠腹腔中提取中性粒细胞,并用烟曲霉菌刺激4小时、8小时、12小时、16小时,q RT-PCR法检测中性粒细胞中Mincle m RNA的表达。TDB和Mincle的中和抗体预处理小鼠腹腔中性粒细胞2小时,然后用灭活的烟曲霉菌刺激中性粒细胞8小时,q RT-PCR法检测FAS、FASL、Caspase3 m RNA的表达,Western blot检测Caspase3的蛋白表达,流式细胞仪检测炎症因子和中性粒细胞的凋亡情况。结果:灭活的烟曲霉菌感染C57BL/6小鼠12小时、1天、3天、5天后角膜中Mincle的m RNA和蛋白比正常对照组中的表达高,在12小时Mincle的m RNA表达最高。TDB处理组和DMSO处理组相比,TDB组Mincle的m RNA表达增多。TDB预处理组烟曲霉菌感染小鼠角膜1天后,Fas、Fasl和Caspase3的m RNA水平与单纯的烟曲霉菌刺激相比显著降低;Ig G预处理组烟曲霉菌感染1天后Fas、Fasl和Caspase3的m RNA水平与Mincle中和抗体预处理组相比显著降低。TDB处理组和DMSO处理组相比,Mincle的蛋白表达升高,TUNEL染色阳性细胞数减少,中性粒细胞数目增多。TDB预处理组烟曲霉菌感染小鼠角膜3天与单纯的烟曲霉菌刺激相比,Fas、Fasl和Caspase3的蛋白水平显著降低,TUNEL染色阳性细胞数减少,而中性粒细胞数目是增多的;Ig G预处理组烟曲霉菌感染3天与Mincle中和抗体预处理组烟曲霉菌感染3天相比Fas、Fasl和Caspase3的蛋白水平显著降低,TUNEL染色阳性细胞数减少,而中性粒细胞数目是增多的。灭活的烟曲霉菌刺激中性粒细胞4小时、8小时、12小时、16小时后Mincle的m RNA和蛋白比正常对照组中的表达高,在8小时Mincle的m RNA表达水平最高。TDB处理组和DMSO处理组相比,TDB组Mincle的m RNA表达增多。TDB预处理组烟曲霉菌刺激小鼠中性粒细胞8小时后,Fas、Fasl和Caspase3的m RNA和蛋白表达水平与单纯的烟曲霉菌刺激相比显著降低,中性粒细胞凋亡率下降;Ig G预处理组烟曲霉菌刺激8小时后Fas、Fasl和Caspase3的m RNA和蛋白表达水平与Mincle中和抗体预处理组相比显著降低,中性粒细胞的凋亡率下降。结论:Mincle参与烟曲霉菌性角膜炎的炎症反应过程,真菌感染后Mincle的表达上调同时中性粒细胞的浸润水平和凋亡数目也是增加的。Mincle还可以通过抑制FAS和FASL的结合来抑制Caspase3的表达进而抑制嗜中性粒细胞凋亡。
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