莱姆病是经硬蜱传播的,由伯氏疏螺旋体引起的人畜共患病。该病呈世界性分布,目前,全球估计年发病人数约为30万人左右,且有不断增长的趋势。在美国,莱姆病有“第二艾滋病”之称,1992年世界卫生组织将此病列为重点防治对象,现已成为全球性的公共卫生问题之一。近年来,对莱姆病病原生物学、致病机理、流行病学、诊断及综合防治方面的研究已取得了一定的成果,但由于伯氏疏螺旋体抗原结构的复杂性以及莱姆病的临床症状的多样性,使得该病的确诊较困难。另外,莱姆病作为一种新发病,在我国对其传播媒介蜱的种类尚未完全明晰,同时关于其病原体的基因型及分类地位均未阐明,这给诊断和防治该病带来极大的挑战。因此,阐明其传播媒介的种类和病原体的分类地位将有助于我们建立高效、快速诊断手段,合理地开展该病的防治工作。本文主要在莱姆病病原体的分类学及其诊断学两个方面进行探索。(1)对源于我国部分林区采集的亚洲璃眼蜱(Hyalomma asiaticum)、长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)等多种蜱种进行伯氏疏螺旋体的检测;(2)对所分离的螺旋体进行分型研究;(3)对所获得的伯氏疏螺旋体鞭毛基因及鞭毛基因的保守区段进行克隆,并在体外表出达伯氏疏螺旋体鞭毛基因保守区段,用保守区段重组蛋白作为莱姆病的诊断抗原,建立莱姆病ELISA诊断方法。第一部分,用套式PCR方法扩增蜱体内的伯氏疏螺旋体鞭毛基因,对采自新疆、青岛和延边等地区的亚洲璃眼蜱和长角血蜱及蜱肠培养物进行检测,对PCR所扩增目的基因片段进行测序,测序结果经GenBank中的blast比对分析。采用BSK-H固体培养基分离培养技术,从蜱肠内分离和纯化伯氏疏螺旋体单克隆,并采用分子生物学方法对分离到的单克隆菌落进行分型。首先对新疆地区的亚洲璃眼蜱和镰形扇头蜱在显微镜下进行解剖,取其肠,用BSK-H液体培养基进行培养,收集蜱肠培养物,提取其基因组DNA,采用套式PCR方法扩增鞭毛基因。然后,对经鉴定含有伯氏螺旋体的肠培养物,利用BSK-H固体培养分离技术,对其进行分离纯化,建立了一种快速而方便的分离伯氏疏螺旋体培养方法。最后,应用recA基因和5S-23S间区基因作为分型的靶基因对分离到的伯氏疏螺旋体单克隆进行初步分型,recA基因是与伯氏疏螺旋体进化相关的基因,其GC含量的变化可以通过荧光定量PCR的熔解曲线很容易的反映出来,根据此特性,用定量荧光PCR熔解曲线对分离到的螺旋体单克隆进行初步分型。经初步分型,本次从亚洲璃眼蜱中分离到伽氏疏螺旋体、狭义的伯氏疏螺旋体等菌株。同时为进一步确定螺旋体基因型,对其5S-23S间区进行PCR扩增,并对扩增产物进行测序,根据其测序结果进一步分型。伯氏疏螺旋体单克隆的分离及初步分型的研究,为莱姆病病原生物学研究奠定了基础。第二部分,对莱姆病血清学诊断技术进行了研究。该研究用重组伯氏疏螺旋体鞭毛基因蛋白作为诊断抗原,建立莱姆病ELISA诊断方法。本研究利用生物工程方法,选取鞭毛基因的氨基酸序列的第131-266区段作为目的片段,对其克隆,连接到PGEX-4T-1表达载体上,构建保守基因片段的重组质粒,然后转化到感受态细胞BL21中,原核表达伯氏疏螺旋体鞭毛基因抗原性和保守性较强的区段的平截性蛋白,用GST.BIND纯化系统纯化伯氏疏螺旋体鞭毛基因重组蛋白,所纯化的蛋白用作诊断抗原;同时将伯氏疏螺旋体分别接种小鼠和兔,两周后收集血清,用上述诊断抗原鉴定,发现经感染的小鼠和兔血清均为阳性血清,建立了敏感性和特异性较高的ELISA诊断方法。此方法为解决莱姆病诊断困难、难以确诊提供了一种有益的借鉴,特别为莱姆病早期的诊断提供了一种有力的手段,且有一定的临床应用价值。综上所述,本研究用简便快捷的固体培养方法对伯氏疏螺旋体单克隆分离株进行分离,并筛选出一种对我国莱姆病病原体分型新方法;建立了检测特异性强、敏感性高的莱姆病血清抗体的ELISA方法。这为有效、快速诊断以及合理防治莱姆病提供理论依据,同时也为该病的流行病学的调查工作开展提供了有力的手段。