发展新的理论和方法，揭示低剂量、长期暴露污染物对DNA损伤或致突变性是污染生态化学面临的挑战之一，未知点突变检测技术的发展已成为环境化学物质遗传突变诊断技术研究的一个重点。五氯酚(PCP)一直被认为是一种有争议的致突变物质，抑癌基因p53基因由于其功能的多样性及与肿瘤发生的高度相关性而备受重视。本项研究以斑马鱼p53基因为目标功能基因，(1)分析斑马鱼DNA功能基因(抑癌基因p53)的全基因结构及氨基酸序列保守性；(2)探索利用DHPLC法检测斑马鱼p53基因点突变检测的实验条件，分析DHPLC技术在环境化合物致突变检测中的可行性；(3)通过体内暴露，研究低剂量五氯酚对斑马鱼p53基因致突变作用，揭示低剂量五氯酚对鱼类DNA功能基因损伤，建立变性高效液相色谱(DHPLC)与DNA克隆测序相结合的方法。本项研究主要目的在于从分子水平上分析和验证五氯酚对脊椎动物点突变作用，进一步深刻认识PCP的致突变性和遗传毒作用，建立一套水环境中有机污染物未知点突变检测技术和遗传毒物诊断方法。 主要研究结果： (1) 斑马鱼p53基因结构分析结果表明：斑马鱼p53基因由11个外显子和10个内含子组成，外显子1和外显子11部分序列不参与编码蛋白质。其cDNA核苷酸序列共2089 bp，包含一个1122 bp的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)(44 bp-1165 bp)，这个ORF编码373个氨基酸。另外在3端有924 bp是非翻译区(3—UTR)，5端同样也存在43 bp的非翻译区(5—UTR)；12种脊椎动物p53氨基酸序列的保守性分析结果表明，在一些特殊的区域，12种氨基酸序列表现出了很高的保守性，这些区域和p53的抑癌功能也密切相关。 (2) 对已知序列的3个含外显子7的斑马鱼p53基因样本片段的DHPLC突变检测分析表明：通过克隆测序方法检测出的点突变，用DHPLC同样可以检出。DHPLC对该片段的最优化检测柱温为60℃，其特异性很好，检测敏感性大于95％。结果表明，DHPLC可以用来筛选斑马鱼p53基因的点突变，并可在将来发展为环境化学物质遗传突变的大通量筛查方法，在应用DHPLC检测点突变时，需要对PCR引物、PCR反应体系以及柱温等参数进行优化选择。 (3) 采用变性高效液相色谱(DHPLC)与克隆测序相结合的方法对含斑马鱼肝脏p53基因外显子7的173 bp的目标片段进行突变分析结果表明：50 μg/L、5(0) μg/L、0.5 μg/L三个浓度暴露10天后扩增的p53基因目标片段的克隆突变率分别为：11.27％±0.62％、8.67％±2.13％、3.88％±1.20％。而0浓度对照组的克隆突变率仅为2.16％±0.41％。经统计学分析，5 μg/L和50μg/L，两个处理组与对照组相比均有显著性差异，表明PCP可以诱导斑马鱼p53基因外显子7的点突变。在所发生的点突变中，A→G，T→C的碱基突变频率明显高于其他类型。 (4) 以斑马鱼为模式动物，将点突变的筛选技术(DHPLC)和确认技术(克隆测序)相结合的复合检测方法体系，即能节约时间、成本和工作量，又能保证对低频点突变的检测灵敏性和特异性，可以用于外来化合物诱导特定基因点突变的检测。