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研究背景:肺炎克雷伯菌（Klebsiella Pneumoniae,KP）是一种较短粗的革兰阴性杆菌,无芽胞,无鞭毛,有较厚的荚膜,多数有菌毛。肺炎克雷伯菌是人类正常微生物菌群主要的组成细菌之一,同时也是一种机会致病菌,当机体免疫力低下时可逃避宿主免疫反应而致病。肺炎克雷伯菌能够扰乱正常的微生物菌群并在胃肠中进行初始定植同时抑制宿主免疫。自20世纪70年代以来,由于抗生素滥用导致多种细菌出现广泛耐药性,近年来多重耐药致病菌的数量急剧增加。多重耐药的肺炎克雷伯菌感染是全球医院感染的主要病因之一,在住院患者中易引起尿路感染、肺炎和腹腔内感染,尤其在医院重症监护病房革兰氏阴性菌感染中,约15%是由多重耐药肺炎克雷伯菌引起。1996年Mackenzie等首次报道耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP）,随后CRKP陆续在美国、英国、雅典、中国等地被发现。碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药的主要原因,它能够有效的水解青霉素、头孢菌素、氨曲南、碳青霉烯类等多种抗生素。碳青霉烯酶的相关耐药基因主要位于质粒和转座子上,很容易在人群中水平传播,因此控制广泛耐药菌的传播和蔓延面临相当的难度。细菌耐药性问题已经成为全世界的公共卫生危机,随着越来越多耐药菌的出现,现阶段的药物研发速度远远落后于苛刻的抗感染治疗需求,因此开发高效的筛选方法去寻找新型抗菌药物的意义重大。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）是一种细小的能独立生活的线虫,线虫通过进食、发育成四个幼虫阶段（L1-L4）,且40%人类疾病相关的基因在秀丽隐杆线虫基因组中具有明确的直系同源性。因此,秀丽隐杆线虫也是研究人类感染性相关疾病的适宜动物模型。本研究拟建立秀丽隐杆线虫-CRKP感染模型,探讨CRKP的感染对秀丽隐杆线虫转录表达谱的影响。并用该模型筛选具有抗菌效应的金属离子浓度。最终建立一个有效的抗菌活性化合物筛选平台及抗感染研究工具。研究方法:收集来源于中国人民解放军广州总医院住院患者血液里培养出的肺炎克雷伯菌,经微生物药敏及PCR鉴定为耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌（CRKP）。将分离的CRKP与秀丽隐杆线虫共培养,摸索CRKP感染线虫的培养条件、感染时间、救治时间等,建立秀丽隐杆线虫-耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌模型。利用RNA测序（RNA-seq）量化在不同的感染时间点秀丽隐杆线虫mRNA表达水平,从而揭示线虫对CRKP感染的反应机制。同时利用构建好的感染模型筛选具有抗CRKP感染的抗菌离子浓度。研究结果:1秀丽隐杆线虫-耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌感染模型的建立将CRKP与秀丽隐杆线虫共培养后发现,感染后的秀丽隐杆线虫自主正弦运动消失,口咽部活动丧失,达到初步感染的状态。如果施加多粘菌素B进行救治,感染后的秀丽隐杆线虫可以恢复到正常活动状态,救治后秀丽隐杆线虫的存活率与药物浓度呈正相关。通过显微镜直接观察秀丽隐杆线虫的存活率评价药物治疗效果。荧光示踪试验显示,CRKP定植于秀丽隐杆线虫的肠道内部,可能通过自身的复制和分泌毒素致使秀丽隐杆线虫死亡。细菌感染秀丽隐杆线虫的最佳培养条件是20%BHI-M9培养基;通过感染浓度优化实验,在不同的感染浓度108 cfu/mL、107 cfu/mL、106 cfu/mL、105 cfu/mL、空白对照下,秀丽隐杆线虫的存活率分别为7.84%、3.44%、6.66%、3.70%、100.00%,不同浓度感染组与空白对照组存活率相比具有显著的统计学差异（χ2=56.44,P<0.0001）。为了快速有效的建立感染模型并减少菌体代谢产物对线虫活性的影响,本研究选择了106cfu/mL的感染浓度进行后续研究。。在此浓度下发现感染24h后可使线虫达到初步感染的目的,加入药物治疗12h后与不加药组相比可达到明显的治疗效果。2耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌感染对秀丽隐杆线虫转录表达谱的影响CRKP感染秀丽隐杆线虫24小时后,air-2、apc-10等与线虫生长有关的基因表达显著下调,秀丽隐杆线虫细胞生长过程被明显抑制。acy-1、itr-1、pal-1和ceh-30等与细胞死亡相关基因表达上调,表明CRKP感染激活秀丽隐杆线虫的死亡进程。研究还发现,秀丽隐杆线虫代谢和食物依赖的关键调节因子daf-7基因参与了基因参与了CRKP感染的相关调控机制,其表达水平的降低可能与秀丽隐杆线虫寿命的缩短有关;在感染早期免疫应答基因如abl-1、lys-1、nlp-29、gst-4、clec-33、clec-54和spp-3表达上调,随着感染时间的延长,基因表达量逐渐下调,表明秀丽隐杆线虫对CRKP感染的免疫防御反应是一个动态过程,随着感染的时间延长宿主免疫防御能力逐渐下降。3利用线虫-耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌感染模型筛选抗菌材料利用构建的秀丽隐杆线虫-CRKP感染模型筛选抗菌金属离子发现,10-5M-10-66 M银离子、10-3M-10-44 M铜离子对CRKP感染具有抗菌性而无毒性。结论:成功构建了秀丽隐杆线虫-CRKP感染模型;发现了CRKP感染秀丽隐杆线虫后诱导与细胞生长、死亡和免疫应答等的部分相关机制;利用该模型筛选出了具有抗菌效应的金属离子浓度。最终建立了一个有效的抗菌活性化合物筛选平台及抗感染研究工具。