胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)的建系受其细胞来源以及培养环境等多种因素的影响,其中来自囊胚的ESCs受囊胚所处发育阶段的影响最大。囊胚形成到囊胚植入子宫壁期间,其多能性细胞处于一种不断自我更新和分化的过程,可能同时存在不同状态的多能性细胞并最终决定其衍生的ESCs的多能性状态。因此,本研究拟探讨不同发育阶段胚胎的多能性基因表达模式及其对分离培养水牛类ESCs效果的影响,并分析其所处的多能性状态,以期确定适合水牛类ESCs分离培养的囊胚发育阶段。首先,对水牛不同发育阶段早期胚胎(桑椹胚、早期囊胚、囊胚、扩张囊胚和孵化囊胚)的多能性相关基因的表达模式进行了分析,发现多能性基因主要在桑椹胚和早期囊胚表达,原始态相关基因KLF4、TBX3和REX-1在这两个阶段高水平表达；囊胚是一个相对沉默的基因表达时期,大部分多能性基因表达下调；扩张囊胚中KLF4、TBX3和REX-1表达量较低且高表达始发态相关基因FGF5。对培养至第5天的水牛胚胎进行2i (1 μmol/mL PD0325901,3 μmol/mL CHIR99021)培养处理,发现2i培养处理对水牛囊胚形成、囊胚细胞数、以及内细胞团含量无显著影响,其多能性基因表达模式与非处理组相似,但表达量均显著低于对照组；其多能性沉默阶段延长至扩张囊胚和孵化囊胚。其次,比较了不同发育阶段囊胚对分离培养水牛类ESCs的效果,并对所获得的类ESCs进行了生物学特性分析。结果发现,扩张囊胚和孵化囊胚的ICM的贴壁率和原始克隆形成率均显著高于早期囊胚和囊胚；2i培养处理早期胚胎后,孵化囊胚源原始克隆直径显著大于对照组(P<0.05)；对不同来源水牛类ESCs原代克隆进行核心转录因子表达分析发现,其OCT4的表达不受囊胚时期来源和2i处理早期胚胎的影响,NANOG和SOX2在扩张囊胚源类ESCs的相对表达显著高于孵化囊胚源类ESCs,2i处理早期胚胎组原始态基因KLF4、TBX3和REX-1的表达高于对照组,孵化囊胚TBX3和REX-1表达显著高于扩张囊胚源类ESCs。对传代培养的水牛类ESCs进行生物学特性分析,发现细胞呈克隆样生长,表达多能性转录因子OCT4、NANOG, SOX2、c-MYC、CDH1、KLF4口TBX3；免疫荧光染色发现,其表达OCT4、SOX2蛋白,弱表达SSEA1、SSEA4和TRA-1-60表面抗原；经诱导能形成可表达GATA4、TUBB3、ACTA2和AFP三个胚层标记基因的拟胚体,能分化形成成纤维样、上皮样和神经样细胞。最后,通过检测细胞X性染色体活性状态、相关多能性基因表达情况和对不同多能性信号的反应,以分析雌性水牛类ESCs所处的多能性状态。结果显示：雌性水牛类ESCs有一条X染色体随机失活；通过RT-PCR检测发现,水牛类ESCs表达原始态相关基因KLF4和TBX3,不表达REX-1,而表达始发态基因FGF5和ACTA2;免疫组化以及Western blot检测再次证实水牛类ESCs表达FGF5,不表达REX-1；水牛类ESCs在细胞因子LIF和bFGF下较好维持其多能性状态,其次是与始发态相关的细胞因子bFGF和Noggin,在原始态相关细胞因子LIF+BMP4中较难维持其多能性状态。水牛类ESCs的基因表达模式和对信号的反应显示与始发态多能性干细胞更接近。以上结果表明：(1)水牛早期胚胎多能性基因表达主要集中在桑椹胚和早期囊胚,囊胚是水牛相对沉默的的多能性阶段,但经2i处理早期胚胎后囊胚的多能性沉默期延迟到扩张囊胚期；(2)水牛扩张囊胚和孵化囊胚有利于类ESCs的衍生,经2i处理早期胚胎后能够促进水牛类ESCs原代克隆的形成,并利于维持原代克隆原始态多能性基因的表达；(3)水牛类ESCs经传代培养后与始发态多能性细胞更接近。