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目的:研究低分子肝素(LWMH)联合更昔洛韦(GCV)体外抗人巨细胞病毒(HCMV)感染的作用。
方法:
1.测定HCMV AD169对人胚肺成纤维细胞(HELF)的毒力将HCMV病毒悬液用维持液按10倍递次法稀释成10-1-10-7的稀释度,每浓度设8孔。向预先培养成单层的HELF加入各稀释度的HCMV液,同时设不加病毒的正常HELF对照组,置于37℃、5％CO2恒温箱内培养。逐日观察细胞特征性病变效应(CPE),记录细胞的病变孔数,待细胞病变不再进展时,根据Reed—Muench法计算半数组织培养感染量(TCID50)。CPE超过50％即(++)以上计为病变孔,(++)以下则计为非病变孔。
2.测定联合药物对HELF细胞的毒性将本实验小组前期试验所得GCV和LMWH的各自半数中毒浓度(TC50)值分别进行倍比稀释,将两种药物均按由高到低浓度互相组合等量混匀,分别加入已长成单层的HELF培养板中,每浓度设4孔,同时设不加药物的正常HELF对照组。同样置于37℃、5％CO2恒温箱内培养。每日倒置显微镜下观察记录联合药物对HELF的病变效应,连续观察5～7d待细胞病变不再继续时,同时用MTT比色法测定A490值。计算各组细胞存活率(CSR),找出联合药物的TD0,使用Probit回归法计算出联合药物对HELF细胞TC50。
3.联合药物体外对HCMV增殖的抑制作用固定联合药物中LMWH的最大无毒浓度(TD0)(625mg·L-1),联合药物中GCV浓度为本实验小组前期测定的其半数抑制浓度(IC50)始倍比稀释的浓度,且各浓度均在联合药物中GCV的TD0以下。先用维持液将HCMV稀释成100TCID50／0.1mL备用。实验分组为LWMH、GCV(35mg.L-1)、GCV(17.5mg.L-1)、GCV(8.75mg.L-1)、LMWH+GCV(35mg.L-1)、LMWH+GCV(17.5mg.L-1)、LMWH+GCV(8.75mg.L-1)7个不同用药组以及病毒对照组(VCG)与正常细胞对照组(NCG),各组均设4复孔。各联合药物组与HCMV等量混匀加入已长成单层的细胞,置于37℃、50％CO2恒温箱内培养2小时,更换维持液,每日倒置显微镜下观察、记录CPE结果。待病毒对照组病变达+++～++++时,采用MTT比色法测定A490值。计算各组药物的病毒抑制率,所得数据用金氏公式计算Q值并判断两药的联合效应。同时运用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法检测联合药物干预后各组HELF细胞HCMV的病毒载量,计算各组药物对HCMV DNA的抑制率。
结果:
1.将病毒原液行连续10倍递次稀释后,本实验测得HCMV AD169病毒株的TCID50=10-4.62／0.1mL。
2.用MTT比色法测定联合药物对HELF细胞的TC50的剂量LMWH为943.6mg.L-1,GCV为567mg.L-1。联合药物TD0中LMWH的浓度是625mg.L-1,GCV的浓度为375mg.L-1。且联合用药对细胞的毒性试验结果及显微镜下观察细胞形态变化显示随着联合用药中二者药物浓度的下降,细胞存活率升高,药物对细胞的毒性作用减弱。
3.当HCMV AD169株浓度为100TCID50感染HELF时,LMWH和GCV均不同程度提高受染细胞的存活率,降低受染细胞的HCMVDNA的拷贝数。
4.当固定LMWH最大无毒浓度,与GCV的3种不同浓度配伍时,结果均在HELF细胞上有明显的抗HCMV的生物活性,并显示配伍后的抑制作用明显大于对应浓度单用GCV的抑制作用(P<0.01)。
5.当联合用药中GCV剂量减半时与全量应用GCV时的抗HCMV效果大约相同(即GCV35mg.L-1组与联合用药LMWH625mg.L-1+GCV17.5mg.L-1组的病毒抑制率和DNA拷贝数比较,无统计学差异,P>0.05)。
结论:体外实验的数据显示,LMWH联合GCV具有良好的体外抗HCMV作用,二者联合具有协同相加抗病毒作用。