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金黄色葡萄球菌是人与动物感染的重要致病菌之一,也是引起奶牛临床和亚临床乳腺炎的主要致病菌,其能产生多种毒素及侵袭性酶,并由于长期的不当使用抗菌药物,导致金黄色葡萄球菌的耐药性增加,这加剧了疾病的发生及治疗成本的增加。金黄色葡萄球菌形成生物被膜后,使它的毒力、对抗菌药物的抵抗力以及对营养剥夺的耐受性增加,从而引起持续性感染,使治疗更加困难。因此,研究生物被膜的形成与调控机制,有助于找到有效的抗金黄色葡萄球菌生物被膜药物与靶点,对预防和治疗金黄色葡萄球菌引起的感染具有重要意义。1.采用微量半定量法对宁夏地区234株牛源金黄色葡萄球菌进行生物被膜检测,结合多种显微镜观察生物被膜及其形成过程,通过MATH试验对细菌进行表面疏水性分析。结果显示,有185株金黄色葡萄球菌能形成生物被膜,阳性率为79.06%;具有亲水性的生物被膜阴性菌株高于生物被膜阳性菌株,并且随着生物被膜的形成能力增加,细菌的亲水性逐渐降低,疏水性逐渐增高;随着生物被膜形成能力的增强,生物被膜逐渐增厚,同时随着培养时间的延长,其结构越来越紧密。2.根据CLSI推荐的微量肉汤稀释法,测定两种状态金葡菌对15种抗菌药物的MIC值。结果显示,浮游态的金葡菌对青霉素耐药率最高,达到94.87%,其次对氨苄西林(85.90%)和磺胺异噁唑(82.05%)的耐药率也较高,而对万古霉素和替米考星敏感率为100%;在生物被膜状态下金葡菌对万古霉素的耐药率为34.37%,对其余14种抗菌药物的耐药率达到90%以上,并且金葡菌在生物被膜状态的MIC值比浮游状态增加了 4-1024倍。3.采用PCR技术对15种生物被膜相关基因进行检测。结果显示,clfA、clfB、sigB、atlE、fib、ebps和icaaD基因的检出率均达到90%以上,fnbpB、bap和sarA基因的检出率较低,未检测出bbp基因;生物被膜阳性菌株atlE、icaA、bap、fnbpB、icaD和SaG基因的检出率显著高于阴性菌(P<0.05)。4.采用RAPD、agr、spa分子分型技术,分析宁夏地区牛源金黄色葡萄球菌的分子流行特征。结果显示,RAPD分型有23株菌未扩增出条带,其余211株金葡菌分为6个型,主要以Ⅳ型为主,占29.06%;agr分型主要以Ⅰ型为主,占61.11%;234株金葡菌被分为20种spa型,主要以t224型为主,其次为t518、t359、t519和t5100。5.采用RNA-Seq测序技术从转录水平研究浮游态与生物被膜态金黄色葡萄球菌的差异。结果显示,两种状态的细菌有1512个基因表达出现了差异,其中有760个基因显著上调,752个基因显著下调;显著差异基因注释到1825条GO条目,且注释基因与79个通路相关。综上所述,本研究通过对宁夏地区奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌进行分子流行特征调查以及生物被膜、耐药性的检测,同时比较两种状态下差异表达基因,挖掘与生物被膜形成相关的基因、信号通路等,为阐明金黄色葡萄球菌生物被膜形成和调控机制奠定了基础。