论文部分内容阅读
F18大肠杆菌是目前养猪业中最普遍、危害最大的肠毒素大肠杆菌病原之一,它可以通过菌毛粘附在小肠上皮细胞上,进而产生肠毒素,引起断奶仔猪腹泻(porcine post-weaning diarrhea, PWD)。尽管当前对仔猪腹泻的一些预防性措施(如提高管理水平、改善卫生环境、注射药物以及亚单位疫苗接种等),在一定程度上减少了该病的发生,但并没有从根本上消除断奶仔猪腹泻和水肿病的发生与流行,采用遗传学方法从遗传本质上提高猪对病原的抗性,对开展抗病育种具有治本的功效。抗原处理相关转运体(Transporter associated antigen processing, TAP)(TAP1是TAP蛋白亚基之一)是细菌内源性抗原肽(如肠毒素)的运输载体,在免疫反应中起着重要的作用。本试验对TAP1基因多态性、基因表达谱和上游序列CpG岛甲基化修饰状态进行系统检测,结合部分免疫应答指标的测定,分析和探讨TAP1基因的遗传变异对断奶仔猪F18大肠杆菌抗性和免疫应答能力的关系,以期为下一步有效分子标记的获得以及TAP1基因调控机制的研究奠定基础。主要试验结果如下：1.采用PCR-RFLP方法对11个猪群体TAP1基因外显子2的多态性进行了检测,共检测到1个等位基因,AA、AB(?)BB3种基因型,其中藏猪仅检测到AB和BB型,其他猪群体中均存在3种基因型。11个群体中等位基因B的频率为0.44-0.95,总体上等位基因B为优势等位基因。大白猪、长白猪、杜洛克和苏太猪群体中BB基因型频率较高,分别为0.906、0.826、0.736、0.603。测序结果发现1个突变位点G729A,为同义突变,没有引起氨基酸的改变。卡方适合性检验结果显示：除了苏太猪和藏猪显著偏离Hardy-Weinbery平衡(P<0.01)外,其余猪种均处于Hardy-Weinbery平衡状态(p>0.05)。2.应用荧光定量PCR方法对从初生到断奶不同日龄(8、19、30和35日龄)、不同猪群体断奶仔猪(苏太猪F18抗性型群体、梅山猪和大白猪)、苏太F18大肠杆菌抗性和敏感型断奶仔猪的11个组织TAP1基因进行差异表达分析,检测结果显示：TAP1基因在11个不同组织中广泛表达,在肺、十二指肠、空肠以及免疫组织脾、胸腺、淋巴组织中高度表达,其中肺和空肠表达量最高,表明TAP1基因的表达可能与肺部疾病和肠道疾病的抗性相关。在不同日龄的仔猪中,8、18、30日龄仔猪TAP1表达水平比较低且无显著性差异(P<0.05),而35日龄的仔猪TAP1表达水平明显高于前3个日龄段(8、18、30日龄),其中在肝、胸腺、十二指肠组织中达到显著水平(P<0.05),在脾、肺、淋巴、空肠中达到极显著水平(P<0.01)。TAPl基因表达量在易感染F18大肠杆菌时期(35日龄)迅速提升,初步反映了TAP1基因可能与F18大肠杆菌抗性相关。同时在F18大肠杆菌抗性群和敏感性群中,F18大肠杆菌抗性型的TAP1基因表达量普遍高于敏感型个体的表达量,在各个组织中TAP1表达量差异倍数从1.430到4.579不等,在胸腺、淋巴结、空肠、十二指肠中表达差异达到4.579、2.822、2.512、1.892。这进一步表明了TAP1基因可能与F18大肠杆菌抗性相关。在不同猪群体中,梅山猪和大白猪之间TAPI表达量无显著性差异,但苏太猪F18大肠杆菌抗性型群体TAP1表达量明显高于梅山猪和大白猪,且其中在肝、肺、淋巴结组织中达到显著水平(P<0.05),在胸腺、脾、十二指肠和空肠组织中达到极显著水平(P<0.01),这一结果同样也表明TAP1基因可能与F18大肠杆菌抗性相关。综合上述结果,表明TAP1基因表达量的上调可能与断奶仔猪F18大肠杆菌抗性和免疫应答有关。TAP1基因外显子2G729A变异位点3种基因型个体的表达结果分析显示：BB基因型个体TAP1表达量普遍高于AA型和AB型,在脾、肺、肾、胸腺、淋巴结、十二指肠和空肠组织中,BB基因型TAP1表达量显著高于AA型和AB型(P<0.05),TAP1多态位点G729A对基因表达具有明显的调控作用,BB基因型有可能作为一个重要的抗性分子标记。3.本研究使用细胞因子酶联免疫分析(ELISA)试剂盒,对大白猪、梅山猪和苏太猪(未选育群体)的IL-2、IL-6、IL-10和IL-12等免疫指标的水平进行了测定,并对其正常值水平进行初步估测。结果显示各免疫指标在不同猪种中的平均值差异比较大,这可能与各猪种对疾病抵抗力不同有关。对比各猪种间的免疫指标水平,发现大白猪和梅山猪IL-2水平显著高于苏太猪(未选育群),而苏太猪(未选育群)IL-6水平显著高于大白猪和梅山猪,梅山猪IL-10水平显著高于苏太猪(P<0.05),3个猪种间IL-12水平无显著性差异。TAP1基因外显子2多态位点G729A对仔猪免疫指标的影响分析结果显示：在大白猪中,BB型个体IL-12水平显著低于AA基因型(P<0.05),结合IL-12功能和大白猪正常值范围,表明TAP1外显子2多态位点BB基因型可能具有较强的一般抗病力。4.通过生物信息学分析,发现TAP1基因上游调控区域存在3个CpG岛,通过启动子区的预测,结合转录因子结合位点等信息,进一步确定-594到-499为调控CpG岛,针对该位点设计引物,应用BSP方法对TAP1基因调控区CpG岛甲基化状态进行分析。不同组织中甲基化状态分析结果显示,该段CpG岛甲基化程度极低,仅在空肠中有甲基化,其他组织均处于去甲基化状态,表明该GpG岛对除空肠外其他组织中的TAP1表达没有明显的调控作用。考虑到F18大肠杆菌主要存在空肠和十二指肠,在接下来的分析主要针对这两个组织,分析从初生到断奶不同日龄(8、19、30和35日龄)、不同猪品种断奶仔猪(苏太猪F18抗性型群体、梅山猪和大白猪)、苏太F18大肠杆菌抗性和敏感型断奶仔猪甲基化状态,结果显示,仅空肠组织存在甲基化位点,而十二指肠均为去甲基化。空肠中甲基化程度随日龄变大而增高,不同猪种间甲基化程度顺序为：苏太猪(抗性群)>大白猪>梅山猪,F18大肠杆菌抗性群体中甲基化程度比敏感性群体高,结合TAP1表达量分析显示,TAP1上游CpG岛甲基化程度与表达量成正相关,因此推测该CpG岛可能对TAP1基因有激活作用。本试验为下一步甲基化检测建立了一个有效的技术平台,由于样本量有限,TAP1基因上游序列的甲基化修饰状态及其调控作用,还有待扩大样本量进行进一步分析。