【摘 要】
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目的:建立一种快速、灵敏、特异定量检测人外周血单个核细胞表达TNF-αmRNA的方法.方法:1、根据Gene Bank中TNF-α mRNA序列和TaqMan-MGB实时荧光定量分析原理,用Primer prem
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目的:建立一种快速、灵敏、特异定量检测人外周血单个核细胞表达TNF-αmRNA的方法.方法:1、根据Gene Bank中TNF-α mRNA序列和TaqMan-MGB实时荧光定量分析原理,用Primer premier 3.0软件设计特异的引物,同时设计一条能与PCR产物特异杂交的探针.在探针的5′端标上荧光报告基团FAM(6-羧基荧光素),探针的3′端标上荧光淬灭基团TAMRA(6-羧基四甲基碱性蕊香红),并在荧光淬灭基团TAMRA后连接上一MGB(Minor groovebinder,DNA小钩结合物)分子——即TaqMan-MGB探针.探针在无特异性PCR发生时,荧光信号不改变;当有特异性PCR扩增发生时,探针会在PCR过程中被Taq酶的5′外切酶活性切断,引起报告基团荧光信号的增长,根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量.2、克隆人TNF-α mRNA实时荧光PCR定量标准:用RT-PCR法从人外周血单个核细胞的总mRNA中逆转录扩增TNF-α cDNA,将纯化的TNF-αcDNA与pUCm-T载体进行连接,转化宿主菌DH-5 α,然后提取重组质粒DNA,用限制性核酸内切酶HindⅢ、EcoR Ⅰ进行双酶切鉴定,用TNF-α引物对重组质粒进行PCR扩增,最后对重组质粒进行测序分析.结论:采用Taqman-MGB实时荧光RT-PCR定量检测TNF-αmRNA表达水平,结果快速、准确、特异、灵敏,具有临床推广价值.本法的建立,为进一研究疾病状态下或药物作用时单核巨噬细胞表达细胞因子的水平及其网络调控提供了可靠的方法.
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