[目的]本研究采用Videman后肢伸直位固定法制备膝骨关节炎兔模型,以股直肌损伤修复为切入点,运用Western blotting和实时荧光定量RT-PCR技术,通过观察KOA模型兔股直Akt、mTOR、4E-BP1、p70s6k的蛋白和基因表达的变化特点和规律,揭示针刀和电针干预治疗膝骨关节炎的股直肌mTOR通路的分子生物学机制,以期发现针刀和电针干预治疗KOA的不同作用途径和作用机制,为临床治疗方案提供实验依据,并揭示中医理论中关于“调筋治骨”的科学内涵。[方法]将36只6月龄清洁级新西兰大白兔通过excel(2016)软件运用随机区组的随机方法,将它们分为4组:正常组、模型组、针刀组和电针组,每组9只,其中1只用于造模成功与否的检验,其他8只用于各项指标的检测。通过采用改良后的Videman左后肢伸直位固定制动的方法造模,对实验性KOA模型兔分别采用针刀、电针两种不同的干预方法进行干预治疗,针刀选取实验性KOA兔左侧后肢股内侧肌、股外侧肌、股直肌、股二头肌等的起止点或肌腹上的条索或结节点进针,刀口线与肌肉肌腱方向平行,分别松解6次,每周2次;电针选取阳陵泉、阴陵泉、内膝眼和外膝眼疏密波,频率2/100Hz,强度3mA,每次10 min,1周3次,共4周对照。实验的第一部分通过观察KOA模型兔的体重、膝关节被动屈伸活动范围、步长、步频等方面进行行为学观察,以及股四头肌湿重和湿重比和大腿围度,并通过MRI对KOA兔膝关节系统整体情况进行影像学观察;通国HE染色在普通光学显微镜下观察KOA模型兔股直肌细胞的形态,肌纤维的粗细和异常的细胞情况,如细胞水肿等。在透射电镜下观察股直肌的超微结构之改变,来比较针刀与电针两种不同干预法之间的疗效区别。在本实验的第二部分Real-time PCR和Western blot技术检测Akt、mTOR、4E-BP1、p70s6k的蛋白表达和基因表达,用免疫组化法检测各组股直肌Akt、mTOR、4E-BP1、p70s6k蛋白相对表达水平,分析针刀干预对KOA模型兔股直肌细胞损伤修复作用机制与mTOR通路的之间的关系。[结果](1)行为学检测:①LequesneMG评分:与正常组相比,模型组的改良后Lequesne MG评分出现明显的提高,(p<0.01)。与模型组比较,针刀和电针组的改良后LequesneMG评分均有显著性改善,且差异有极显著性统计学意义(p<0.01)。②膝关节被动活动度:和正常组比较,模型组的PROM有显著下降,(p<0.05)。与模型组比较,针刀组的PROM有统计学差异(p<0.05)。③步长:较正常组相比,模型组的步长显著减少有极显著性差异(P<0.01),与模型组比较,针刀和电针组的步长均有恢复,并且均有极显著性改善(P<0.01)。④步频:与正常组比较,模型组的步频明显走低,有极显著差异(P<0.01)。与模型组相比,电针的步频表现出明显的提升,并具有极显著差异(P<0.01)。(2)体重、股四头肌湿重和大腿围度①治疗后体重:和正常组相比较,模型组的治疗后体重有极显著的统计学差异(P<0.01),与模型组相比,针刀组的体重有显著提高,且有统计学差异(P<0.05)。②股四头肌湿重:各组之间股四头肌的湿重(绝对值)中,与正常组比较,模型组的股四头肌的湿重值显著低于正常组,(P<0.05),与模型组比较,电针组的股四头肌湿重值明显上升,有统计学差异(P<0.05)。③大腿围度:在大腿最粗的地方测量差异性最大,与正常组比较,模型组围度明显变小,具有极显著差异(P<0.01)。与模型组比较,针刀组与模型组有显著性差异(P<0.05),针刀的围度比模型组有所恢复。(3)形态学检测:①光镜观察:正常组肌束排列整齐有序整齐,大小均匀,细胞与细胞之间间隙匀称,间质未见水肿及炎细胞浸润;模型组肌束肌束排列紊乱,大小不一,多个肌纤维萎缩,细胞间质水肿,少量炎细胞浸润;针刀组及电针组较模型组均出现肌细胞的增大和再生,同模型组比较,骨骼肌纤维的横截面积明显增大,细胞间质水肿减轻。②肌纤维横截面积:较正常组相比,模型组的KOA模型兔的肌纤维横截面积缩小明显,具有极显著差异(p<0.01)。针刀组和电针组与模型组相比,肌纤维横截面有所恢复,具有极显著差异(p<0.01)。(4)各组实验兔股直肌透射电镜观察结果:正常组兔股直肌透射电镜下,显示易染色质和常染色质,肌筋膜肌浆网、血管、线粒体、肌板结构正常,正常组兔股直肌细胞核(未见位移)的位置正常,细胞核结构完整正常,肌丝(粗肌丝,细肌丝)、肌节结构正常,肌丝排列正常,易染色质和常染色质正常,肌筋膜,肌浆网(未见扩长)正常,血管结构正常,线粒体结构正常,糖原正常,肌板完整。模型组:肌糖原增多,线粒体嵴模糊不清,肌浆网明显减少(运动受影响),线粒体形态不好,线粒体膜不完整,局部肌丝有破坏,肌丝有断裂(肌力受影响),核周间隙扩张。肌筋膜凹陷出现锯齿样改变。Z线消失,肌节紊乱,线粒体增多,肌丝断裂缺失。线粒体浓缩,凝聚。线粒体在肌筋膜下增多,糖原也增多,出现肌萎缩,血管尚可,脂滴,肌丝、肌节破坏,线粒体嵴出现断裂,有损伤有代偿(糖原增多)。针刀组:肌丝有缺失,附近糖原增多聚集,肌筋膜有轻度锯齿样改变,筋膜下糖原增多形成糖原湖,粗细较均匀,肌节较清晰,明、暗带较明显,Z线结构较正常,少量线粒体水肿,筋膜下线粒体增多(代偿性修复),线粒体嵴模糊。电针组:肌原纤维排列无序,粗细较均匀,肌丝断裂,在肌丝缺失的地方糖原增多集聚,出现糖原湖,肌节较清晰,明、暗带可辨,少量Z线排列异常,线粒体嵴模糊,线粒体肿胀且数目略增多。(5)造模后1周各组KOA兔左侧膝关节MRI显示结果:正常组可见实验兔膝关节周围软组织正常,关节面光滑关节间隙正常,半月板影清晰,没有赘生物;模型组KOA兔膝关节周围软组织如股直肌等出现明显萎缩,左侧膝关节关节腔内出现高密度影,滑膜增生改变,股骨关节面出现增生和变形,关节间隙内侧明显变窄,较正常组关节间隙明显降低,甚至出现了软骨的损伤;针刀组KOA兔膝关节周围软组织如股直肌的萎缩有所恢复,较模型组的股直肌更丰满些,关节腔内未见明显增生物,双侧的膝关节间隙比模型组宽,而且比较均匀,但是左侧膝关节关节腔内出现高密度影,滑膜增生改变,胫骨平台软骨关节面欠平滑;电针组KOA兔膝关节周围软组织如股直肌的萎缩有所恢复,比模型组的股直肌更饱满,左侧膝关节腔内出现高密度影(滑膜增生)改变,程度较模型组减轻,股骨关节面出现缺损,胫骨关节面出现唇样增生,较正常的关节间隙明显变窄。(6)用免疫组化法(IHC法)检测各组股直肌Akt、mTOR、4EBP1和P70s6k蛋白的表达水平,与正常组比较,模型组股直肌mTOR和P70S6K、Akt蛋白的表达水平低于正常组,差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,针刀组和电针组的股直肌Akt、mTOR和P70s6k有显著的上升,有显著统计学意义(P<0.01)。与正常组比较,针刀组与电针组股直肌Akt、mTOR和P70s6k表达水平没有统计学差异。针刀组、电针组和模型组的股直肌4EBP1表达水平较正常组降低,但无统计学差异(P>0.05);针刀组和电针组mTOR和Akt蛋白的表达水平均明显高于模型组,针刀组P70s6k蛋白的表达水平高于模型组,具有统计学差异(P<0.05);而电针组股直肌P70s6k蛋白的表达水平与模型组相比,没有统计学差异(P>0.05)。说明针刀和电针刺激均能增加兔股直肌mTOR和AKT蛋白相对表达水平,针刀能增加兔股直肌P70S6K的蛋白表达水平。(7)Western blot检测结果:用Western blot法检测各组股直肌mTOR和p70s6k、Akt和4EBP1蛋白的表达水平,用目标蛋白条带光密度值/内参GAPDH蛋白条带光密度值作为相对表达量进行统计分析,结果如图所示:与正常组比较,模型组股直肌mTOR和P706s、AKT蛋白的表达水平显著降低(P<0.01);与模型组比较,针刀组和电针组股直肌mTOR蛋白水平有明显的升高(P<0.01,P<0.05)。各组之间股直肌4EbP1表达水平无统计学差异(P>0.05);说明针刀和电针刺激均能增加兔股直肌mTOR和AKT蛋白相对表达水平,针刀干预能增加兔股直肌p70s6k蛋白的表达水平。(8)Real-time PCR 检测各组股直肌 Akt、mTOR、p70s6k 和 4EBP1 的 mRNA 结果:(1)Akt的mRNA表达:与正常组比较,模型组极显著降低(p<0.01);与模型组比较,针刀组有显著的升高(p<0.05)。(2)mTOR的mRNA表达:与正常组比较,模型组显著降低(p<0.01);与模型组比较,针刀组和电针组均有极显著的升高(p<0.01)。(3)4EBP1的mRNA表达:正常组、模型组、针刀组和电针组各组间比较4EBP1的mRNA表达无统计学差异(p>0.05)。(4)p70s6k的mRNA表达:与正常组比较,模型组显著降低(p<0.01);与模型组比较,针刀组和电针组均有极显著的升高(p<0.01)。[结论](1)通过膝关节行为学评分,关节被动活动度测量,HE染色观察股直肌,透射电镜观察肌纤维的超微结构变化,大腿围度的测量,股四头肌湿重和湿重比,以及MRI均证明了:运用Videman左后肢制动的方法复制KOA模型不仅会造成膝关节周围股直肌、股四头肌、乃至整个大腿部的肌肉都出现了损伤和萎缩,还造成了软骨的损伤是成功的废用性KOA的模型。通过透射电镜观察,实验兔左后肢的股直肌超微结构提示本研究中KOA模型造成了兔股直肌的损伤,针刀和电针组均促进了股直肌的再生修复过程,相比较之下电针组的透射电镜结果更好一些。(2)针刀和电针干预的治疗方法均都对实验性KOA模型兔股直肌损伤有修复的作用,针刀组干预后肌纤维横截面积显著增加,关节的被动活动度,大腿围度增加、体重也增加,这些指标具有一致性,表现出来肌细胞的增大和肌纤维横截面积的增加。电针干预后表现出股四头肌湿重的增加,步长的显著增大和步频的明显加快,这些指标综合在一起可能说明电针干预后肌肉的肌力得到改善,运动功能和疼痛状况得到恢复。这些指标的不同,反应出来针刀和电针干预的作用机制并不相同。(3)针刀干预能够使得KOA模型兔的行为学评分明显得到提高,股直肌纤维横截面积增大,大腿围度增大,体重显著增加,同时Akt、mTOR和p70s6k的mRNA和蛋白高表达,都显示出针刀干预使得Akt/mTOR通路被激活,从而发挥对对受损萎缩的骨骼肌进行修复,从而发挥对骨骼肌的保护作用。(4)针刀干预能有效改善KOA临床症状其机制可能是通过激活Akt、mTOR和p70s6k的表达,进而使得Akt/mTOR信号通路发挥促进骨骼肌的增大和修复的作用,Akt/mTOR通路的激活可能是针刀发挥骨骼肌损伤修复作用的机制之一。