研究背景骨质疏松症是一种以骨强度降低,骨组织微结构损坏,导致骨脆性增加,易发生骨折为特征的全身性疾病[1]。骨质疏松症分为原发性和继发性骨质疏松症两大类,原发性骨质疏松症以绝经后骨质疏松症多见。有效的抗骨质疏松药物可以增加骨密度,改善骨质量,降低骨质疏松性骨折的发生率。单纯应用抑制骨吸收药物或促进骨形成药物,疗程期内可以明显提高骨量,但治疗停止后疗效难以长期维系,有证据显示[2,3]延长双膦酸盐类药物的疗程并不能获的更多的骨收益,反而会遭遇平台状态[4];且疗程延长后药物的副作用也进一步凸显,双膦酸盐类药物疗程超过5年,增加下颌骨坏死、非典型性骨折的风险,长时间使用特立帕肽会增加骨肉瘤的风险[5,6]。为绝经后骨质疏松症患者寻找一种长期、有效、可靠的治疗方案,以及如何有效预防骨质疏松性骨折的发生依旧是巨大的挑战。为了追求更大疗效,药物序贯治疗不失为一种好的思路,Leder等[7-9]指出促进骨形成药物(特立帕肽)序贯抑制骨吸收药物(阿仑膦酸钠、狄诺塞麦)可以显著提升腰椎骨密度,其疗效要大于单用一种药物或两种药物联合应用。但这种新型的序贯方案很快受到质疑,Bo Abrahamsen[10]指出促进骨形成药物序贯抑制骨吸收药物之所以取得好的疗效,原因在于首先应用促进骨形成药物可以为新生骨矿化提供足够的时间,如果提供充足的新骨矿化时间,首先应用抑制骨吸收药物序贯促进骨形成药物同样可以取得良好的效果,前后两种序贯方案之间本应没有差异,只是顺序不同而已。因缺乏有力的理论依据,促进骨形成药物序贯抑制骨吸收药物方案的临床研究进程受阻,且特立帕肽序贯狄诺塞麦治疗费用高昂,致使新方案难以真正推广。尽管如此,不同方案的序贯疗法依然广泛存在于临床实践之中,例如,单用一种机制药物疗程到期或疗程期内出现了副作用,可以改换另一种作用机制的药物延续治疗,序贯方案也因此产生了。因此,针对序贯疗法的研究仍具有现实的临床基础条件。但目前所报道的有关骨质疏松症序贯疗法的文献中大多只有疗效的报道,几乎没有涉及序贯疗法起效原因的理论分析,且鲜有长期随访报道,有关序贯疗法的研究及临床推广亟需理论性突破。结合以往的研究,我们将序贯疗法治疗骨质疏松症的思路进行了重新的梳理与延伸:序贯疗法治疗骨质疏松症可以不局限于骨形成促进剂与骨吸收抑制剂之间的组合方式,其他作用机制药物与促进骨形成药物或抑制骨吸收药物的组合方案需要进一步尝试及研究;序贯疗法方案作用机制的研究,包括预先应用一种作用机制药物是否可以减轻或者消除另一种药物的副作用或不良反应;两种药物之间是否存在协同、累加或拮抗作用;长期用药的安全性,患者的依从性及经济负担问题。综合考量各种抗骨质疏松药物的作用机制及副作用、患者依从性、治疗花费等诸多因素之后,我们提出了新的序贯治疗方案,并将维生素K2和唑来膦酸作为候选药物。维生素K2(四烯甲萘醌,MK4)具有促进骨形成作用[11,12],而且可以阻止成骨细胞凋亡、维持成骨细胞数量及活性[13],通过抑制NF-κB的活性进而抑制破骨细胞的生成[14,15]。唑来膦酸属于三代双膦酸盐类药物,可抑制破骨细胞活性,具有强大的抗骨吸收能力,每年一次输注5mg即可达到治疗效果,高效便捷的给药方式可以显著提高患者对治疗的依从性。但近年来唑来膦酸对骨转换的持续抑制逐渐受到重视,有研究表明当唑来膦酸浓度高于10-8mol/L时可对成骨细胞的增殖、分化及功能产生影响[16]。由此可见,两种药物对破骨细胞的作用基本一致,对成骨细胞的影响却不同。在新序贯方案中,维生素K2是否可以拮抗唑来膦酸对成骨细胞的抑制作用成为我们研究的重点内容。如果维生素K2的应用减轻或者消除了唑来膦酸对成骨细胞的抑制,假定唑来膦酸抑制骨吸收能力不受影响的前提下,成骨细胞就可以更好地发挥促进骨形成作用,使骨的净收益增加,从而提高疗效。作为新序贯方案基础层面的研究,我们设计体外及体内实验分别验证维生素K2序贯唑来膦酸方案的作用及疗效。体外实验:通过细胞实验检验单一、联合及不同序贯药物方案对成骨细胞的活性、矿化能力的影响,进一步检验联合及序贯方案中两种药物之间是否存在协同、累加或拮抗作用,通过检测成骨细胞相关基因表达的变化阐释维生素K2序贯唑来膦酸发挥成骨细胞保护作用的主要作用机制。体内实验:通过建立绝经后骨质疏松症动物模型,检测单一、联合及不同序贯药物方案对骨质疏松大鼠的骨密度、骨小梁形态结构、骨的生物力学、骨钙及骨胶原含量以及骨表面骨转换标记物的影响,进一步验证维生素K2序贯唑来膦酸方案的有效性。本课题研究的创新性和先进性在于:①首次运用维生素K2序贯唑来膦酸疗法治疗绝经后骨质疏松症;②新序贯方案属于其他作用机制药物序贯骨吸收抑制剂的范畴,突破了以往促成骨制剂序贯破骨抑制剂的药物组合常规;③首次从细胞水平验证序贯疗法对成骨细胞的影响,并阐述新序贯疗法的主要作用机制;④新序贯方案相对特立帕肽序贯骨吸收抑制剂而言,可以有效的降低治疗费用,提高患者依从性,减轻患者经济负担。目的:研究维生素K2序贯唑来膦酸对成骨细胞影响,通过动物实验验证新序贯疗法的疗效,并阐释新序贯疗法的主要作用机制。研究方法:(1)细胞实验部分。首先测定两种药物干预成骨细胞72小时的IC50值,然后将两种药物配置成0.125、0.25、0.5、1、2、4倍IC50值的6种浓度,将相同IC50倍数值浓度下的两种药物进行144小时的联合或序贯方案干预,实验方案设溶剂对照、维生素K2组、唑来膦酸组、维生素K2联合唑来膦酸组、维生素K2序贯唑来膦酸组、唑来膦酸序贯维生素K2组。MTT法测定6种浓度下各方案中成骨细胞的活性,并计算两种药物的联合用药指数。茜素红染色观察不同浓度及不同方案干预下的成骨细胞形态及矿化情况,细胞孔内钙含量测定可以定量检测成骨细胞矿化能力。检测成骨细胞Bcl-2、Bax、Runx2及Sost基因表达变化并进一步阐释维生素K2序贯唑来膦酸疗法的作用机制。(2)动物实验部分。取76只20周龄的Wistar大鼠建立去势大鼠模型,将其分为假手术组、单纯去势组、维生素K2组、唑来膦酸组、维生素K2联合唑来膦酸组、维生素K2序贯唑来膦酸组、唑来膦酸序贯维生素K2组,然后依照分组用药方案进行为期12周的药物干预,干预结束前进行双荧光标记,大鼠牺牲后收集股骨、胫骨及血液进行检测,指标包括:双能X线法检测股骨骨密度,Micro-CT检测股骨骨小梁形态及相关骨小梁参数,万能应力试验机测试股骨抗折弯能力,将近端股骨灰化后测骨钙含量,酸水解法检测远端股骨羟脯氨酸含量,胫骨近端骨组织切片结合双荧光标记法检测骨小梁表面骨转换情况,采集外周血检测血生化指标并进行凝血酶原时间测定。结果:(1)同IC50倍数浓度下单用唑来膦酸相对于单用维生素K2而言表现出对成骨细胞增殖、分化及矿化的抑制作用;预先给予维生素K2可部分拮抗唑来膦酸对成骨细胞的抑制作用,成骨细胞活力及矿化能力均较单用唑来膦酸有明显提升;在联合用药及唑来膦酸序贯维生素K2方案中,维生素K2协同唑来膦酸一致表现为对成骨细胞的抑制作用,致使成骨细胞活力及矿化能力均出现不同程度的降低,尤其以联合用药时为甚。(2)维生素K2通过有效提升Bcl-2/Bax的比值发挥抗成骨细胞凋亡作用,通过上调RunX2基因的表达促进成骨细胞的分化与成熟,此外还可以下调Sost基因表达促进成骨细胞的矿化作用;而唑来膦酸通过上调Sost基因表达抑制成骨细胞矿化的作用。维生素K2序贯唑来膦酸后Bcl-2/Bax的比值仅次于单用维生素K2组,表现出一定的抗成骨细胞凋亡能力,此外通过上调RunX2的表达促进成骨细胞的分化与增殖,通过下调Sost基因表达促进矿化进程;而维生素K2联合唑来膦酸、唑来膦酸序贯维生素K2却表现出相反趋势,联合用药组较唑来膦酸序贯维生素K2的相反趋势更加明显。(3)相对于单纯去势大鼠而言,单用维生素K2可以提高去卵巢大鼠的骨密度、改善骨小梁结构、提高骨钙含量、促进骨形成及骨矿化的作用;单用唑来膦酸可以提高去卵巢大鼠的骨密度、部分改善骨小梁结构、提高骨钙含量,但抑制骨形成及骨的矿化;维生素K2序贯唑来膦酸可以显著提高去卵巢大鼠的骨密度、显著改善骨小梁结构、显著提升骨的弹性模量、显著提高骨钙含量、促进骨形成及骨矿化作用,并且较其他方案更有优势;唑来膦酸序贯维生素K2可以提高骨密度,改善骨小梁结构、提升骨钙含量,但其疗效结果与单用唑来膦酸结果相比,没有明显的提升作用;维生素K2联合唑来膦酸在改善骨密度、骨小梁结构、骨钙水平方面没有任何优势,与去卵巢大鼠相比没有任何治疗作用。结论及意义:预先给予维生素K2可部分拮抗唑来膦酸对成骨细胞的抑制作用,使得成骨细胞的分化、增殖及矿化进程得到最大程度的保护,在假定唑来膦酸抑制破骨能力不变的情况下,减少对新骨形成的抑制作用,最终提高骨量及骨质量,提高骨的净收益;其作用机制在于提升Bcl-2/Bax的比值抗成骨细胞凋亡,上调RunX2基因的表达促进成骨细胞的分化与成熟,下调Sost基因表达促进成骨细胞的矿化。相比之下,唑来膦酸序贯维生素K2的疗效与单用唑来膦酸无明显差异,而维生素K2联合唑来膦酸相对单纯去势组无明显疗效。因此,维生素K2序贯唑来膦酸是骨质疏松症长期治疗的合理方案选择,可以为临床治疗骨质疏松症提供新的治疗方案。