鼻气管鸟杆菌病(Ornithobacterium rhinotracheale,ORT)是一种严重危害养鸡业的呼吸道传染病,ORT在临床上常危害3～6周龄的肉鸡及火鸡,引起急性呼吸道病,近年来给养鸡业造成了较大的经济损失。鼻气管鸟杆菌病的防治主要采用在饲料或饮水中添加抗生素治疗以及通过疫苗进行免疫预防两种方法。由于抗生素治疗存在弊端,目前国外研发了包括活疫苗、灭活疫苗和重组疫苗等,用于预防鼻气管鸟杆菌病。本研究采用甲醛灭活菌体研制油乳剂灭活苗,同时应用基因工程技术原核表达蛋白基因,纯化表达产物,进行动物免疫保护试验,评价两种疫苗的免疫抗体水平以及免疫保护率,旨在为鼻气管鸟杆菌病的防治奠定基础。1 鼻气管鸟杆菌生物学特性研究本研究将实验室冻存的ORT分离株进行复壮及鉴定,按常规操作进行革兰氏染色,生化鉴定,PCR鉴定以及动物回归试验所得结果与国外报道的分离株相似,且血清学检测结果表明分离株为血清型A型。而后采用分光光度法及平板菌落计数法测定鼻气管鸟杆菌生长曲线,并对16h鼻气管鸟杆菌OD600nm与CFU的关系进行探讨,结果显示,绘制的生长曲线基本一致,由此可得鼻气管鸟杆菌对数生长期为2～16h,稳定期为16～20h,20h以后进入衰亡期,并且建立适用于鼻气管鸟杆菌对数生长期的OD60nm与CFU的回归方程为:y=2.7591x-0.0897(R2=0.9973)。最后进行了半数致死量的测定,根据改良寇氏法计算得LD50=1.19×1010CFU/mL,为了有效地利用和控制鼻气管鸟杆菌的生长提供了参考。2 鼻气管鸟杆菌油乳剂灭活苗的研制本研究利用戊二醛处理聚苯乙烯酶标板,将鼻气管鸟杆菌的全细胞抗原进行干燥包被,通过方阵滴定试验确定最佳抗原包被浓度为108CFU/mL,血清最佳稀释度为1:100,并且通过试验确认其具有较好的特异性以及重复性。将分离鉴定的鼻气管鸟杆菌培养至对数生长期后用0.2%甲醛溶液灭活24h,制备灭活苗,对疫苗进行质量检验,结果表明,疫苗乳化效果良好,无菌生长,内毒素含量符合要求,将7日龄的SPF肉鸡接种疫苗后无不良反应。分别在鸡7日龄和14日龄接种疫苗,用间接ELISA法检测其抗体水平,并在21日龄对免疫组及攻毒组鸡只进行攻毒,对免疫效果及攻毒保护能力进行评估,结果显示两次接种疫苗后不同抗原含量的疫苗均有较好的免疫效果,能够预防鼻气管鸟杆菌的感染。3 鼻气管鸟杆菌外膜蛋白疫苗的研制将实验室构建并冻存的重组菌PGEX-OMA87复苏后,大量表达纯化OMA87蛋白,与弗氏佐剂1:1乳化,以7日龄SPF鸡为实验动物,对疫苗进行质量检验,结果显示疫苗乳化效果良好,无菌生长,内毒素含量符合要求,SPF肉鸡接种后无不良反应。对免疫效果及攻毒保护能力进行评估,结果显示两次接种疫苗后不同抗原含量的疫苗均有较好的免疫效果,能够有效预防鼻气管鸟杆菌的感染。