背景和目的:随着人们生活习惯及饮食模式的改变,能量的摄入远远大于消耗,与长期静坐等不良生活方式等协同作用,导致超重及肥胖的发生,与此同时,与肥胖密切相关的并发症,例如心血管疾病、高血压等的发生率也逐年上升。因此,预防肥胖的发生发展有重大的意义。肥胖不仅表现在白色脂肪组织(WAT)异常扩增,棕色脂肪组织(BAT)功能障碍,即BAT白色化,亦在肥胖发生发展中起到关键作用。BAT因血管丰富且富含线粒体,具有产热及抑制能量储存的作用,因此与机体的整体代谢密切相关。肥胖和衰老可导致BAT减少及功能异常,表现为解偶联蛋白-1(UCP-1)表达下调、脂滴聚集及线粒体功能障碍,即BAT白色化。其中,线粒体功能障碍与肥胖发生发展密切相关。然而,BAT中导致线粒体功能障碍的机制非常复杂,氧化应激、呼吸功能障碍、离子稳态失衡均发挥重要作用。因此探讨调节BAT线粒体功能与能量代谢的关系,对于抑制BAT白色化及预防肥胖的发生有重要的意义。即往的研究表明,瞬时受体电位通道香草酸亚型1(TRPV1)的特异性选择激动剂-辣椒素,可通过激活TRPV1抑制高脂饮食(HFD)诱导的肥胖,而这种作用可能与哺乳动物Sirtuins家族中的沉默信息调节因子3(SIRT3)也有关联。SIRT3隶属于NAD+依赖的去乙酰化酶家族,主要分布于线粒体上。研究发现SIRT3缺失的小鼠线粒体呼吸过程中活性氧(ROS)产生增多并出现线粒体功能障碍,而作为线粒体内唯一的去乙酰酶,SIRT3的缺失也与线粒体蛋白乙酰化的失调密切相关。细胞内的Ca2+受到严密的调控,Ca2+稳态的失衡与高血压、肥胖及糖尿病等多种疾病密切相关。作为细胞的能量中心,线粒体功能与Ca2+稳态关系更加密切,长期高水平的Ca2+能障碍密切相关。定位于线粒体内膜上的线粒体钙离子单向转运体(MCU)是调节线粒体钙摄取的关键关节。而SIRT3是否参与辣椒素对HFD诱导的肥胖和BAT白色化的抑制,SIRT3与Ca2+稳态及线粒体的功能的具体关系,目前仍不清楚。为此,我们通过在体及离体实验探讨SIRT3在肥胖发生发展中的作用以及与Ca2+稳态和线粒体功能之间的关系,以更好的预防及控制肥胖的发生发展。材料和方法:本试验分为在体及离体两部分。在体试验分为两部分:1)以野生型小鼠(WT)、SIRT3全身敲除(SIRT3 KO)及TRPV1全身敲除小鼠(TRPV1 KO)为研究对象,分别予以普食(ND)、高脂饮食(HFD)及高脂辣饮食(HFCD)喂养32周。分组情况为普食WT组(WT-ND)、普食SIRT3-KO组(SIRT3 KO-ND)、普食TRPV1-KO组(TRPV1 KO-ND),高脂WT组(WT-HFD)、高脂SIRT3-KO组(SIRT3 KO-HFD)、高脂TRPV1-KO组(TRPV1 KO-HFD),高脂辣WT组(WT-HFCD)、高脂辣SIRT3-KO组(SIRT3 KO-HFCD)、高脂辣TRPV1-KO组(TRPV1 KO-HFCD),每组各10只。测量各组小鼠各项生理生化指标的变化,探讨辣椒素及SIRT3对体重、能量代谢的影响。离体实验以原代培养的野生型(WT)及SIRT3敲除(SIRT3 KO)小鼠的棕色脂肪细胞为研究对象,探讨SIRT3在肥胖发生中的分子机制。方法:1.测量小鼠体重、摄食量、空腹葡萄糖耐量实验(IPGTT)、BAT、WAT重量以及通过HE染色观察脂肪细胞面积。2.通过动物代谢系统(CLAMS)测量能量消耗(EE)及呼吸商(RER);通过DHE探针标记来检测细胞线粒体氧化应激(ROS)的变化。3.通过线粒体呼吸功能测定系统测定线粒体呼吸功能。4.通过荧光比率仪、全波长酶标仪检测胞浆和线粒体钙的摄取情况。5.通过West-blotting、rt-PCR明确TRPV1、SIRT3、MCU、MICU1、AMPK、UCP-1、PRDM16、PGC-1α等蛋白、m RNA表达。结果:1.与WT-ND组相比,WT-HFD及SIRT3 KO组体重显著增加;与HFD喂养相比,HFCD可显著降低肥胖的发生,但在SIRT3 KO及TRPV1 KO小鼠中作用消失,但各组小鼠摄食量无明显差异。HFD喂养可导致显著的糖耐量异常,HFCD可改善糖耐量异常,但在SIRT3 KO及TRPV1 KO小鼠中HFCD的作用消失。脂体比及HE染色结果显示,与WT-ND组相比,除WT-HFCD组外,均有棕色脂肪组织白色化表现。2.HFD喂养导致UCP-1、PRDM-16及PGC-1α表达显著下降,伴随能量消耗(EE)、氧耗、二氧化碳产生及线粒体氧化呼吸功能下降,而胞浆及线粒体ROS产生显著增加。辣椒素可逆转HFD引起的相应改变,但是其作用在SIRT3 KO小鼠中消失。3.辣椒素可抑制HFD喂养导致棕色脂肪细胞线粒体Ca2+摄取增加,但是在SIRT3KO小鼠中该作用消失。离体实验中,辣椒素可缓解棕榈酸引起的线粒体Ca2+超载,沉默Sirt3导致该作用消失,而过表达SIRT3可显著抑制PA引起的线粒体Ca2+超载。4.辣椒素可抑制HFD喂养导致的MCU及MICU1增加,但是该作用在SIRT3 KO小鼠中消失。离体实验中,过表达MCU抑制SIRT3过表达对线粒体Ca2+超载及功能的改善作用,而沉默Mcu逆转Sirt3沉默或SIRT3敲除导致的线粒体Ca2+超载。5.染色质免疫共沉淀(Ch IP)发现,辣椒素可降低MCU启动子区域H3K27乙酰化水平,伴随MCU表达下降,而沉默Sirt3增加该位点乙酰化水平。抑制H3K27乙酰化水平可抑制MCU表达,同时降低PA引起的线粒体Ca2+摄取。抑制AMPK或沉默AMPKα增加H3K27乙酰化水平及MCU表达,而激活AMPK抑制H3K27乙酰化及MCU表达。6.HFD喂养导致BAT中p-AMPK、PGC-1α及SIRT3显著下降,辣椒素可抑制HFD的作用。离体实验中亦表现出一致的结果。激活AMPK或过表达PGC-1α可促进SIRT3表达,而抑制AMPK或沉默Pgc-1α降低其表达。Ch IP结果表明,PGC-1α可与Sirt3启动子区域结合,且该过程可被辣椒素及AMPK激活,而被PA抑制。结论:1.肥胖导致棕色脂肪组织SIRT3表达明显下调。给予辣椒素激TRPV1抑制棕色脂肪组织白色化,预防肥胖发生,但SIRT3敲除时辣椒素抑制肥胖的作用消失。研究表明,SIRT3在棕色脂肪白色化中发挥重要作用,是辣椒素干预肥胖的关键分子。2.高脂饮食导致线粒体功能障碍,给予辣椒素可改善线粒体功能,而SIRT3敲除时则改善作用消失。提示SIRT3在辣椒素激活TRPV1中可减轻氧化应激,延缓线粒体呼吸功能障碍中发挥重要作用,与抑制棕色脂肪白色化密切相关。3.AMPK激活SIRT3,后者通过降低MCU启动子区域H3K27乙酰化水平减少其表达而改善线粒体Ca2+超载。在肥胖病理状态下,AMPK活性受抑导致SIRT3表达降低,引起并加重线粒体Ca2+超载,而给予辣椒素干预可逆转该效应。提示AMPK/SIRT3在辣椒素激活TRPV1改善线粒体Ca2+超载及抑制BAT白色化中发挥重要作用,是SIRT3是改善BAT白色化预防肥胖的分子机制。