目的　　 血管瘤是一种常见的血管内皮肿瘤，在我国的发病率约为0.3％～1%，具有一系列广泛的临床表现。从良性的婴幼儿血管瘤，恶性度低的血管内皮瘤，到多发于成人的恶性血管肉瘤。血管瘤及相关的血管畸形可见于多种先天性遗传性疾病，通常伴有多种组织器官发育缺陷。到目前为止，血管瘤形成的分子及细胞学机制仍然不清。与正常血管内皮细胞相比，血管瘤内皮细胞增殖、侵袭能力增强。血管内皮细胞过度增殖，病理性血管生成是血管瘤形成的主要生物学行为。PI3 K/Akt信号转导通路在广泛的人类肿瘤谱中失调，该通路某些成分的突变所导致的功能获得或功能缺失能够引起细胞转化，该通路是调节内皮细胞生存、血管生成的主要信号调节途径，在血管瘤中表现出异常激活。VEGF是该信号通路主要的信号刺激因子。AKT是该信号通路的中心调控点，其完全磷酸化由Thr308和Ser473磷酸化组成。AKT Thr308磷酸化由上游激酶PDK1激活，而Ser473则由mTORC2磷酸化激活。AKT完全磷酸化是其发挥生物学功能所必需的。哺乳动物AKT有三种亚型：Akt1，Akt2 and Akt3。这三种亚型由严格区分却又高度同源的基因编码。特异性AKT亚型基因敲除鼠研究表明，不同AKT亚型表现出不同的功能。目前，AKT亚型特异性功能研究成为肿瘤研究中的热点。雷帕霉素是mTOR抑制剂，根据不同细胞类型发挥不同程度的mTORC1和mTORC2抑制作用，动物研究表明，雷帕霉素可以显著抑制实体瘤中AKT的活性及病理性血管生成。本研究探讨血管瘤中AKT信号传导通路的调节作用；通过慢病毒介导的shRNA靶向沉默AKT磷酸化的上游激酶PDK1、mTORC2-RICTOR，探讨这两种AKT上游激酶对AKT活性及血管瘤的生长、增殖及侵袭的影响及其作用机制；探讨低剂量雷帕霉素对血管瘤的治疗作用；探讨AKT三种亚型对良、恶性血管瘤生长、增殖、侵袭的影响及其作用机制。　　 实验材料：　　 实验用EOMA细胞，293T细胞由哈佛医学院，Laura Benjamin实验室提供，婴儿血管瘤组织、原代婴儿血管瘤内皮细胞、人皮肤微血管内皮细胞、ASM.5细胞及正常人皮肤组织、小鼠血管内皮细胞由哈佛医学院Carole Perruzzi友情赠送及技术支持。实验动物为裸鼠，4-6周，雌性(Charles River，MA)。实验所用AKT信号通路相关抗体、VEGF/VEGF受体等抗体均购于Cell SignalingTechnology。LY-294002(L9908)购于Sigma。　　 实验方法：　　 1、慢病毒介导的shRNA靶向基因沉默靶向PDK1、RICTOR、AKT1、AKT2、AKT3的小鼠shRNA序列克隆到pLKO慢病毒表达载体中。该质粒由哈佛大学LeslieWardwell，RNAi Facility，Dana-Farber Cancer Institute构建。在293T细胞内包装成慢病毒颗粒，转染靶细胞。　　 2、Western Blot方法检测各种蛋白激酶激活及表达情况。　　 细胞经含有蛋白酶及磷酸酶抑制剂的细胞裂解液作用后，提取细胞总蛋白，调节蛋白浓度均等，在4%-20%的Tris-Glycine胶上上样，每孔蛋白量为20ug。电泳后转移至硝酸纤维素膜，加入适当比例稀释的一抗孵育过夜，第二天加入HRP标记的二抗作用后，进行膜孵育及曝光检查蛋白表达情况。　　 3、利用WST-1细胞增殖检测法检测血管瘤细胞增殖能力。　　 4、Transwell Matrigel方法检测血管瘤细胞侵袭转移能力。　　 5、体外出芽实验检测血管瘤细胞新生血管形成能力。　　 6、免疫组织化学方法检测几种人类良、恶性血管瘤中AKTSer473位点磷酸化表达情况。　　 结果：　　 1、人血管瘤中AKT磷酸化活性异常增高福尔马林固定，石蜡包埋的人良、恶性血管瘤组织经AKT磷酸化Ser473位点的抗体染色，结果表明，与邻近的正常血管组织比较，在所选血管瘤组织中，都表现出AKT Ser473磷酸化表达增强。　　 2、慢病毒介导的shRNA靶向沉默PDK1、RICTOR及AKT三种亚型的表达Western Blot结果表明，shRNA成功抑制了各个靶蛋白的表达，获得了稳定沉默靶蛋白的血管瘤细胞。　　 3、PDK1、RICTOR基因表达沉默下调AKT磷酸化水平，从而抑制血管瘤生长、增殖及侵袭Western Blot结果表明：PDK1、RICTOR基因沉默分别抑制AKT在Thr308位点和Ser473位点的磷酸化。与EOMA空白对照组相比，PDK1、RICTOR基因沉默明显抑制肿瘤细胞生长、增殖及侵袭。靶向PDK1、RICTOR基因治疗将会是血管瘤治疗的一条新途径。　　 4、小鼠活体内实验表明雷帕霉素可以显著抑制血管瘤的生长。　　 裸鼠侧腹注射EOMA细胞，分别给与DMSO及雷帕霉素(0.1ng/ml)每日腹腔注射，治疗12天。有研究表明，该治疗剂量血中雷帕霉素浓度约为5.47ng/ml，这一浓度正处于雷帕霉素临床治疗用药浓度的下限(6-15ng/ml)[1]。与对照组相比较，在较低用药剂量下，雷帕霉素发挥显著的血管瘤生长抑制作用。证明了雷帕霉素在血管瘤治疗中的重要意义。　　 5、AKT1促进肿瘤生长、增殖及侵袭，而AKT3则发挥明显的抑制作用。　　 AKT1和AKT2表达缺失明显抑制而AKT3表达缺失则明显促进血管瘤细胞基础的及VEGF诱导的新血管形成过程。与pLKO对照组比较，AKT1表达缺失明显抑制血管瘤生长，而AKT3表达缺失则显著促进血管瘤生长。AKT2表达缺失没有显著的统计学差异。除了肿瘤大小外，没有观察到AKT三种亚型对血管瘤组织形态特征及局部侵袭能力的明显区别。AKT1促进而AKT3抑制血管瘤生长、增殖及侵袭，这表明AKT1为血管瘤生长所必需，而AKT3则发挥完全相反的负性调节作用，这为研制开发AKT亚型特异性抑制剂提供了重要的理论基础。　　 结论：　　 本研究证实，血管瘤中存在AKT信号传导通路的异常过度激活；靶向沉默AKT磷酸化上游激酶--PDK1、mTORC2-RICTOR可以降低AKT磷酸化活性，从而显著抑制血管瘤生长、增殖及侵袭能力；AKT1和AKT3在血管瘤的生长、增殖及侵袭过程中具有完全相反的调节作用--AKT1促进而AKT3显著抑制血管瘤生长。另外，本研究还证实低浓度雷帕霉素具有显著的抑制血管瘤生长的作用，显示出雷帕霉素重要的抗血管瘤临床应用价值。除此之外，对血管内皮细胞肿瘤形成机制的研究和深入理解，将为内皮细胞生物学研究提供坚实的理论基础，帮助我们更好的理解其他的与病理性血管生成相关的疾病的发病机制，通过调节信号传导通路活性状态的方法达到肿瘤治疗的目的，为肿瘤基因治疗提供新策略。