持续的慢性肝损伤导致肝脏正常的细胞功能被破坏,细胞外基质合成与降解失去平衡,最终导致肝纤维化的发生。肝脏受到慢性肝损伤刺激后,肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）活化成α-SMA⁺收缩型的肌纤维母细胞样细胞,增殖和迁移能力增加,同时释放促炎和促纤维化因子。HSCs也具有免疫功能,能够表达功能性的趋化因子受体和趋化因子,包括CXCL1、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CCL2、CCL3和CCL5。CXCL1,也被称为Groα,是G蛋白偶联受体CXCR2的配体。CXCL1参与HSCs的活化,促进纤维化和血管生成。我们之前的研究表明CD147在肝纤维化和肝硬化组织中表达上调,同时能够促进HSCs的活化。HSCs在活化持续阶段,有增殖和趋化因子/细胞因子释放等细胞表型的变化。然而,目前对于活化HSCs中趋化因子分泌的调控机制仍未完全明了。因此,我们本研究的第一个目的是证实CD147能否调控HSCs分泌趋化因子CXCL1,从而在免疫调控方面理解CD147在HSCs活化及其纤维化发生中的作用。另一方面,我们前期的工作也证明,CD147也在肝癌细胞高表达。肝脏由慢性炎症以及肝损伤发展为肝纤维化,进一步恶化为肝硬化,最终可能发展成为肝癌,在此过程中涉及多种细胞亚群的相互作用。在肝纤维化进程中HSCs的活化和增殖发挥了重要的作用。而CD147在肝癌细胞和活化HSCs的表达是否介导了癌细胞与HSCs的相互作用,以及对CXCL1释放的增强?因此,本研究的第二个目的是构建同时敲除肝细胞和HSCs中CD147基因的小鼠模型,为深入研究CD147在肝脏疾病中的功能提供动物模型,并进一步检测CXCL1的表达。第一部分:CD147上调肝星状细胞CXCL1表达的机制研究方法小鼠腹腔注射CCl₄（4周和8周）建立小鼠肝纤维化模型,利用实时PCR、免疫组织化学染色法和免疫组织荧光染色法检测小鼠肝脏组织中CXCL1的表达以及活化HSCs中CXCL1和CD147的表达。为研究CXCL1对HSCs活化的影响,加入重组的人源CXCL1蛋白刺激LX-2细胞,检测HSCs的活化标志物α-SMA和I型胶原蛋白的表达,以及细胞收缩和细胞增殖等细胞生物学行为的变化。在LX-2细胞中分别瞬时转染CD147或者利用siRNA干涉CD147后,实时PCR和western blot检测CXCL1的表达。同时利用HSC特异性敲除CD147基因的小鼠模型(GFAP-Cre;Bsg^fl/fl)进一步验证体外实验结果,即通过分离GFAP-Cre;Bsg^fl/fl小鼠原代HSCs,流式细胞术检测CXCL1的表达。GFAP-Cre;Bsg^fl/fl小鼠腹腔注射CCl₄8周诱导小鼠肝纤维化形成,ELISA检测肝纤维化模型小鼠血清中CXCL1的含量。为探究CD147调控CXCL1的机制,在过表达CD147的LX-2细胞中加入PI3K/AKT抑制剂LY294002后,western blot检测CD147、CXCL、AKT和p-AKT的表达。结果随着CCl₄诱导时间的增长,小鼠肝脏组织中CXCL1表达呈时间依赖性的增加。CXCL1在肝细胞和间质细胞上均有表达,活化的HSCs（α-SMA⁺）中CXCL1的表达增加。加入重组的人源CXCL1蛋白刺激,LX-2中α-SMA和I型胶原蛋白上调表达,细胞收缩加剧,细胞增殖能力提高。在CCl₄诱导的肝脏纤维化组织中,活化的HSCs中CXCL1与CD147存在共定位,提示我们CD147可能对CXCL1存在调控。在LX-2细胞中瞬时转染CD147后,CXCL1的表达上调;反之用siRNA干涉CD147后,CXCL1的表达下降。在小鼠模型中我们得到相似的结果,与同窝对照小鼠相比,GFAP-Cre;Bsg^fl/fl小鼠原代HSCs中CXCL1表达下降。CCl₄诱导的GFAP-Cre;Bsg^fl/fl小鼠血清中CXCL1含量降低。过表达CD147的LX-2细胞中加入PI3K/AKT抑制剂LY294002后,LY294002能够抑制由CD147上调引起的AKT磷酸化水平和CXCL1的表达。结论本研究证实CXCL1在肝纤维化中高表达,同时能促进HSCs的活化表型增加。CD147通过PI3K/AKT信号通路上调HSCs中CXCL1的表达。第二部分:肝细胞和肝星状细胞同时特异性敲除CD147基因的小鼠模型构建及CXCL1表达的检测方法通过杂交肝细胞特异性敲除CD147基因的小鼠和HSCs特异性敲除CD147基因的小鼠获得肝细胞和HSCs共同敲除CD147基因的小鼠模型(命名为Bsg^HEP+HSC),通过鼠尾提取基因组,PCR扩增后对小鼠进行基因型鉴定。记录小鼠3¹2周体重变化,对小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏进行HE染色。实时PCR和western blot检测小鼠各组织中CD147的表达。原代分离敲除小鼠的肝细胞和HSCs,利用流式细胞术分别检测敲除小鼠原代肝细胞和HSCs中CD147的表达。实时PCR检测敲除小鼠肝脏中CXCL1的表达。结果PCR检测Bsg^HEP+HSC小鼠的全基因组,可分别扩增出大小为405bp的CD147-Loxp产物、200bp的GFAP-Cre产物和361bp的ALB-Cre产物。与同窝对照小鼠相比,Bsg^HEP+HSC小鼠体重变化无明显差异,也未在心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏发现自发性病变。敲除小鼠肝脏的CD147呈特异性下调,原代肝细胞和原代HSCs中CD147表达降低。Bsg^HEP+HSC敲除小鼠肝脏中CXCL1的表达显著下降。结论成功构建肝细胞和HSCs同时特异性敲除CD147基因的小鼠模型,CD147基因在肝细胞和HSCs表达均降低,敲除小鼠肝脏组织中CXCL1表达下降。