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禽流感(Avain Influenza,AI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的鸟类病毒性传染病,高致病力毒株(Highly Pathogenic Avain Influenza Virus,HPAIV)的流行可导致感染鸡群的死亡率达100%。
禽流感血凝素(HA)蛋白是禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)最主要的保护性抗原,它不仅可以诱导特异性抗体的产生,还可以刺激机体产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。以禽流感血凝素(HA)蛋白研制的亚单位疫苗可对同一H亚型不同毒株产生良好的免疫保护性。探索禽流感血凝素(HA)基因在植物中的表达,提高禽流感血凝素(HA)基因的表达量,对于研制禽流感亚单位疫苗具有重要意义。
本研究以烟草瞬时表达系统为基础。首先,根据烟草密码子的偏好性,对禽流感血凝素(HA)基因进行优化。其次,确定了该基因表达产物定位在细胞间隙,有利于选择血凝素(HA)蛋白的提取和纯化方案。再次,通过在起始密码子前添加Kozak序列、去掉表达载体pB2GW7.0上的抗除草剂筛选标记等措施,使禽流感血凝素(HA)基因的表达量得到了显著提高。本研究主要是通过在烟草叶片中瞬时表达禽流感血凝素(HA)基因,进而期望能生产禽流感亚单位疫苗。主要研究结果如下:
根据烟草密码子的偏好性,在保证氨基酸序列不变的情况下,对选定的禽流感血凝素(HA)基因序列进行优化。
构建亚细胞定位植物表达载体pXT225,将禽流感血凝素(HA)基因与载体pK7FWG2.0上的GFP融合表达,转化烟草后用荧光激光共聚焦显微镜观察叶片,确定了禽流感血凝素(HA)基因表达产物定位在细胞间隙,这对于后来蛋白提取方法的确定提供依据。
构建了pXT227、pXT228、pXT229三个植物表达载体。将禽流感血凝素(HA)基因(带6×His标签)直接构建到空表达载体pB2GW7.0上,即得到表达载体pXT227;将5’端加Kozak序列的禽流感血凝素(HA)基因(带6×His标签)构建到空表达载体pB2GW7.0上,即得到表达载体pXT228;将5’端加Kozak序列的禽流感血凝素(HA)基因(带6×His标签)构建到改造的空表达载体pB2GW7.0(DeleteBar)即pXT226上,得到表达载体pXT229。分别用含三个表达载体的农杆菌注射烟草叶片,结果表明,在RNA水平和蛋白水平都能表达禽流感血凝素(HA)基因,并且禽流感血凝素(HA)基因在注射含表达载体pXT229农杆菌的烟草叶片中表达量最高。
瞬时表达一般发生在4-8天,为了确定最佳收获叶片的时间。本实验还评估了烟草叶片注射含表达载体pXT229的农杆菌后,禽流感血凝素(HA)基因在不同时期的表达量。结果显示,在第六天时禽流感血凝素(HA)基因的表达量最高。